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1材料與方法

1．1流式細胞術檢測細胞凋亡取對數生長期BGC-823細胞以5×105•ml－1接種于6孔板中，分為對照組、香芹酚處理組，每組設3個復孔，加藥48h后，收集各組細胞，PBS洗2次，離心棄上清，懸于結合緩沖液中，調整細胞濃度為1×106•ml－1。加5μlAnnexinV-FITC和PI混勻液，避光室溫孵育10min。用結合緩沖液洗1次后用流式細胞儀進行檢測分析。AnnexinV(－)PI(－)為活細胞，AnnexinV(－)PI(+)為機械損傷細胞，AnnexinV(+)PI(－)為早期凋亡細胞，AnnexinV(+)PI(+)為晚期凋亡細胞，實驗中以AnnexinV(+)作為凋亡細胞［8］。

1．2Transwell檢測細胞侵襲能力Matrigel基質膠包被Transwell上室內膜。無血清細胞培養(yǎng)液調整BGC-823細胞密度，按5×103•ml－1的密度接種上室，同時加入終濃度為80μmol•L－1的香芹酚，下室加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于48h后取出上室，4%甲醛固定15min，晾干后結晶紫染液染色5min，倒置顯微鏡下觀察拍照。33%冰醋酸洗凈結晶紫，收集洗脫液酶標儀檢測(A573nm)［9］。

1．3QuantitativeRealtime-PCR檢測MMP-9、TIMP-1mRNA的表達80μmol•L－1香芹酚處理48h的BGC-823細胞作為實驗組;未處理的BGC-823細胞作為對照組。按Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，電泳鑒定并定量后，依據Takara公司逆轉錄說明書將提取的RNA逆轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR反應:SYBR反應體系共25μl，反應條件:95℃2min，95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)，溶解曲線95℃2min，95℃15s，60℃1min，95℃15s。以2-ΔΔCt表示計算目的基因mRNA的相對表達量，每組重復3次取平均值。所檢測的目的基因和內參基因的相關引物設計合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列見表1。

1．4Westernblot檢測相關蛋白的表達收集細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量。取各組總蛋白40μg進行SDS-PAGE，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1h，一抗4℃孵育過夜。加入1∶5000倍稀釋二抗，37℃孵育1h，ECL法進行底物發(fā)光，曝光成像后掃膜分析。

1．5統(tǒng)計學分析采用SPSS18．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量數據以x珋±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2．1香芹酚對胃癌BGC-823細胞的增殖抑制效應MTT檢測結果顯示，不同濃度香芹酚處理細胞24h、48h、72h后，能夠顯著抑制胃癌BGC-823細胞的生長，香芹酚處理組與陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，并且抑制效應呈濃度、時間依賴性，結果如圖1所示。根據香芹酚對胃癌BGC-823細胞的生長抑制率計算出其作用48h的IC50分別為78．6μmol•L－1。

2．2香芹酚對胃癌BGC-823細胞凋亡的影響香芹酚處理胃癌BGC-823細胞48h后，使用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞術檢測，結果如圖2所示，隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡率也相應增加，呈劑量效應關系，差異均有統(tǒng)計學意義(細胞凋亡率:0μmol•L－1vs10μmol•L－1，0μmol•L－1vs20μmol•L－1，0μmol•L－1vs40μmol•L－1，0μmol•L－1vs80μmol•L－1;P均＜0．0001)，結果表明香芹酚能夠有效誘導胃癌細胞的凋亡。

2．3香芹酚對胃癌BGC-823細胞侵襲的影響80μmol•L－1香芹酚處理胃癌BGC-823細胞48h后，使用Matrigel-transwell法檢測細胞侵襲能力，結果如圖3所示。同對照組相比，香芹酚處理組胃癌BGC-823細胞侵襲能力明顯降低(0μmol•L－1vs80μmol•L－1，P＜0．0001)，結果表明香芹酚能夠降低胃癌細胞細胞的侵襲能力。

2．4香芹酚對胃癌BGC-823細胞PARP、Caspase-9表達的影響香芹酚處理胃癌BGC-823細胞48h后，使用Westernblot檢測香芹酚對細胞PARP、caspase-9表達的影響，結果如圖4所示。同對照組相比，香芹酚處理組胃癌BGC-823細胞出現PARP裂解片段且caspase-9的表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．0001)。

2．5香芹酚對胃癌BGC-823細胞MMP-9、TIMP-1表達的影響香芹酚處理胃癌BGC-823細胞48h后，使用實時熒光定量PCR檢測香芹酚對細胞MMP-9、TIMP-1mRNA表達的影響，結果如圖5所示，香芹酚處理組細胞MMP-9的表達明顯降低，而TIMP-1的表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．0001)。

2．6香芹酚對胃癌BGC-823細胞MAPK信號通路的影響香芹酚處理胃癌BGC-823細胞48h后，使用Westernblot檢測香芹酚對細胞ERK、P38的激活情況，結果如圖6所示，各組總ERK以及總P38的表達均無明顯變化(P＞0．05)，香芹酚作用后磷酸化ERK表達有所降低，而磷酸化P38的表達有所升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．0001或0．01)，結果表明香芹酚抑制了ERK的激活同時促進了P38的激活。

3討論

香芹酚化學名稱5-異丙基-2-甲基苯酚，又名異麝香草酚，是牛至油以及百里香油的主要成分，為一種安全的食品添加劑，常應用于糖果、飲料和口香糖的生產中［9］。研究表明，香芹酚有著廣泛的生物活性，如抗炎、抗氧化以及抗腫瘤等效應。Aru-nasree［6］研究發(fā)現香芹酚作用于轉移性乳腺癌細胞株MDA-MB231后，乳腺癌細胞的增殖能力明顯降低，且凋亡明顯增加，推測其可能通過增加線粒體釋放細胞色素C以及激活caspase等所致。Koparal等研究表明香芹酚作用于非小細胞肺癌細胞株A549后，細胞增殖能力呈劑量依賴性的降低，同時DNA斷裂，出現細胞凋亡，表明香芹酚對肺癌具有細胞毒性作用。Yin等將不同濃度的香芹酚作用于肝癌細胞株HepG2，結果顯示肝癌細胞增殖受到抑制且凋亡細胞明顯增加。本研究利用香芹酚處理胃癌細胞，結果顯示胃癌BGC-823細胞增殖活性明顯受到抑制，凋亡明顯增加且侵襲能力降低，表明香芹酚具有一定的抗胃癌作用。

細胞內的一系列凋亡級聯(lián)反應中均有caspase的參與，其中caspase-9為凋亡級聯(lián)反應下游重要的效應酶。PRAP在維持DNA完整性上發(fā)揮著重要作用并被作為細胞凋亡的標志。若PRAP發(fā)生降解則失去對DNA完整性的保護作用，使核酸內切酶活性增高，裂解核小體間的DNA，從而引發(fā)細胞凋亡。本研究中香芹酚作用后胃癌細胞中PRAP出現了裂解的片段，且caspase-9表達升高，結果表明香芹酚能夠有效誘導腫瘤細胞的凋亡活性。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通路主要包括ERK、P38以及JNK三條通路，其在細胞增殖、凋亡以及分化過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，腫瘤組織中ERK通路常處于異常的激活狀態(tài)，P38信號則參與多種細胞凋亡途徑，P38的激活能夠誘導c-Myc、p53以及Fas/FasL等多種凋亡相關蛋白的表達，從而誘導凋亡。ERK通路的激活能夠抑制細胞的凋亡，而抑制ERK信號通路能夠誘導細胞凋亡。近期研究顯示香芹酚作用于肝癌細胞后，磷酸化ERK的表達顯著降低，而磷酸化P38顯著升高，但JNK未發(fā)生明顯變化，本研究將香芹酚作用胃癌細胞后同樣檢測到ERK活性的降低，P38活性的升高，表明香芹酚誘導胃癌細胞凋亡的過程可能與ERK及P38信號通路相關。

胃癌易發(fā)生轉移且目前尚無有效的治療手段。腫瘤細胞侵襲轉移為一個多步驟的生物學過程，其中細胞外基質和基底膜的降解是腫瘤的轉移的重要環(huán)節(jié)，其中基質金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制劑(TIMPs)在此過程中發(fā)揮著關鍵作用［19］。香芹酚處理組組細胞侵襲能力顯著降低同時MMP-9表達受到抑制而TIMP-1表達升高，提示香芹酚在抑制胃癌細胞侵襲的過程中也發(fā)揮著一定的作用。ERK信號轉導通路參與MMPs表達的調節(jié)，抑制ERK的激活能夠阻礙腫瘤的侵襲［20］，由此推測香芹酚抑制胃癌侵襲的作用可能與ERK通路的抑制有關，但此過程是否還有其他通路的參與及其詳細的作用機制還有待于進一步研究。

作者：孫時華姜榮華祝海燕姜建軍單位：江山市中醫(yī)院浙江省衢州市人民醫(yī)院浙江省江山市人民醫(yī)院