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1材料與方法

1.1研究方法

1.1.1Westernblot法依照蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行各細(xì)胞株總蛋白的提取，BCA定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，樣品定量為5g/L，于每條泳道進(jìn)行上樣50μg蛋白，采用12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺進(jìn)行凝膠電泳，在電壓70V條件下經(jīng)80min電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗，在4℃條件下孵育過夜。TBST洗膜后，加入二抗室溫條件下孵育1.5h，TBST清洗，采用ECL發(fā)光，以凝膠顯像儀進(jìn)行顯像。采用QuantityOne進(jìn)行灰度值檢測(cè)。

1.1.2qRT-PCR法按照RNA分離試劑盒及TRIzol試劑盒說明書步驟提取并純化各細(xì)胞株總RNA，所有RNA樣本濃度均稀釋至1g/L，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒說明書規(guī)定步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。總RNA濃度測(cè)定：用DEPC水調(diào)零后取1.5μL樣品置于ND-1000全波長(zhǎng)紫外/可見光掃描分光光度計(jì)測(cè)樣臺(tái)上進(jìn)行測(cè)量，對(duì)A260/A280值以及濃度進(jìn)行記錄，總RNA樣品在A260/A280為1.8~2.0，RNA純度較高，無DNA、蛋白質(zhì)等污染，濃度為100~1458.2μg/μL。總RNA完整性檢測(cè)：取RNA樣品1μL，1%瓊脂凝膠電泳80V電壓電泳20min，EB染色10min，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并進(jìn)行拍照。結(jié)果顯示5sRNA、18sRNA、28sRNA條帶完整，總RNA抽取完整。RT-PCR反應(yīng)體系為（2×All-in-OneqPCRMix10μL，45×SyberGreen2μL，PrimerF1μL，PrimerR1μL，cDNA2μL，ddH2O4μL），反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10min；95℃變性10s、60℃退火20s、72℃延伸10s，45個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)立復(fù)孔，并以DEPC水代替模板，cDNA作為陰性對(duì)照。

1.1.3siNDRG1及陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞siNDRG1及陰性對(duì)照序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。轉(zhuǎn)染前24h取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，分別以10×104和20×104/孔接種至24孔板中，對(duì)融合達(dá)到70%~90%的細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分3組：空白對(duì)照組、siNDRG1組及陰性對(duì)照組。對(duì)siNDRG1組及陰性對(duì)照序列組依照LipofectamineTM2000試劑說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h后按照miRNA提取及分離試劑盒說明書步驟進(jìn)行總RNA完整性檢測(cè)，應(yīng)用紫外線分光光度儀檢測(cè)RNA溶解光密度值A(chǔ)（介于260~280nm處比值），計(jì)算RNA的濃度及純度，比值為1.8~2.1者可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。采用Westernblot法及qRT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)染后PANC-1細(xì)胞中NDRG1在蛋白水平及mRNA水平表達(dá)的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測(cè)。并采用Westernblot法及qRT-PCR對(duì)PANC-1細(xì)胞siNDRG1轉(zhuǎn)染后MMP-7在蛋白水平及mRNA水平表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.1.4MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PANC-1細(xì)胞增殖取各組PANC-1細(xì)胞，按MTT試劑盒操作步驟，以5×103細(xì)胞/孔密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，并設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72、96、120h后，每孔內(nèi)加入5mg/mLMTT液2μL，繼續(xù)進(jìn)行溫育4h，棄上清后加入DMSO150μL，進(jìn)行振蕩溶解結(jié)晶，比色選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上進(jìn)行各孔光吸收值測(cè)定，并重復(fù)3次試驗(yàn)，取平均值。

1.1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PANC-1細(xì)胞調(diào)亡PANC-1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染48h后，取各組細(xì)胞，依照AnnexinV-FITC/PI試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀AlexaFITC最大激發(fā)波長(zhǎng)488nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為509nm，PI-DNA復(fù)合物最大激發(fā)波長(zhǎng)為535nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為615nm，采用軟件CellQuest進(jìn)行分析。AlexaFITC為X軸，PI為Y軸，每個(gè)樣本采集為10000個(gè)細(xì)胞，區(qū)分開早期調(diào)亡細(xì)胞、晚期調(diào)亡細(xì)胞及繼發(fā)壞死細(xì)胞區(qū)，計(jì)算出陽性細(xì)胞的百分比例，并重復(fù)3次試驗(yàn)，取平均值。

1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用PASWStatistics18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，Westernblot、qRT-PCR及MTT結(jié)果采用GraphPadPrism6.0進(jìn)行單因素方差分析及作圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1胰腺癌細(xì)胞株的Westernblot法檢測(cè)結(jié)果NDRG1（60kDa）在PANC-1、BXPC-3、CAPAN-2、SW1990細(xì)胞株中均有表達(dá)，低分化細(xì)胞（PANC-1）中NDRG1蛋白水平表達(dá)較中分化（BXPC-3）及高分化細(xì)胞株（CAPAN-2、SW1990）高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.4，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=7.23，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=8.65，P<0.01）；MMP-7（28kD）在4種細(xì)胞株中表達(dá)與NDRG1的趨勢(shì)一致（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.5，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=9.27，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=10.58，P<0.01）。

2.2各細(xì)胞株的qRT-PCR檢測(cè)4組細(xì)胞株中NDRG1及MMP-7在mRNA水平均有表達(dá)，低分化細(xì)胞（PANC-1）中NDRG1在mRNA水平表達(dá)較中分化（BXPC-3）及高分化細(xì)胞株（CAPAN-2、SW1990）高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.15，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=9.35，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=9.95，P<0.01）；MMP-7的mRNA在4種細(xì)胞株中表達(dá)趨勢(shì)與NDRG1一致（PANC-1vs.BXPC-3：q=3.27，P<0.05；PANC-1vs.CAPAN-2：q=8.66，P<0.01；PANC-1vs.SW1990：q=9.17，P<0.01）。

2.3Westernblot及qRT-PCR對(duì)siNDRG1轉(zhuǎn)染效果的檢測(cè)Westernblot與qRT-PCR結(jié)果顯示，siNDRG1轉(zhuǎn)染組PANC-1細(xì)胞NDRG1蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯低于空白對(duì)照組（均P<0.05），但陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）（圖3）。

2.4siNDRG1轉(zhuǎn)染后MMP-7蛋白與mRNA表達(dá)變化Westernblot結(jié)果顯示，siNDRG1轉(zhuǎn)染組PANC-1細(xì)胞MMP-7蛋白與mRNA表達(dá)水平均明顯低于空白對(duì)照組（均P<0.05），但陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）（圖4）。2.5MTT檢測(cè)siNDRG1干擾后PANC-1細(xì)胞增殖變化空白對(duì)照組、siNDRG1轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組PANC-1細(xì)胞增殖率72h：（62.53±9.45）%、（42.26±10.24）%、（59.87±6.19）%；96h：（83.26±6.47）%、（51.39±11.29）%、（79.98±7.04）%；120h：（84.67±7.12）%、（61.57±4.38）%、（81.43±7.84）%。siNDRG1干擾后PANC-1細(xì)胞增殖能力受到抑制，在72、96、120h與空白對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.454，P<0.01；t=12.367，P<0.01；t=3.733，P<0.05），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)siNDRG1干擾后PANC-1細(xì)胞調(diào)亡變化siNDRG1組、空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組PANC-1細(xì)胞凋亡率分別為17.59%、0.45%、0.24%，siNDRG1組與陰性對(duì)照組或空白對(duì)照組比較，調(diào)亡率明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），陰性對(duì)照組或空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

胰腺癌以發(fā)現(xiàn)晚、治療效果差、預(yù)后差及病死率高為特點(diǎn)。經(jīng)多中心研究顯示，胰腺癌的1年生存率低于20%，5年生存率低于5%。80%以上的患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移。患者均死于癌腫惡性生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)。胰腺導(dǎo)管腺癌在胰腺癌病理分型中占80%~90%[11]。目前無論是手術(shù)、放療及化療均不能顯著提高患者的生存率。針對(duì)胰腺癌相關(guān)基因靶向治療是目前的研究熱點(diǎn)。胰腺癌的發(fā)生及發(fā)展是多基因的協(xié)同作用的結(jié)果。本研究顯示，在蛋白水平，NDRG1及MMP-7在PANC-1、BXPC-3、CAPAN-2、SW19904組細(xì)胞株中均有表達(dá)，在低分化細(xì)胞PANC-1中NDRG1在蛋白水平表達(dá)較中分化BXPC-3及高分化細(xì)胞株CAPAN-2、SW1990中高，提示，NDRG1及MMP-7可能參與惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化行為，NDRG1及MMP-7表達(dá)上調(diào)會(huì)導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞分化程度差，惡性度增高。在mRNA水平，NDRG1及MMP-7在PANC-1表達(dá)較BXPC-3及CAPAN-2、SW1990中高，提示NDRG1及MMP-7對(duì)胰腺癌細(xì)胞分化及惡性生長(zhǎng)行為的調(diào)節(jié)在基因水平即已發(fā)生。NDRG1作為α/β水解酶，具有磷酸泛酰巰基乙胺序列，能夠活化氨基酸及脂肪酸，在細(xì)胞生長(zhǎng)分化及細(xì)胞周期中起到重要作用，參與腫瘤細(xì)胞的蛋白水解代謝，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化潛能，細(xì)胞周期從G1期向G2期轉(zhuǎn)化。NDRG1沒有水解酶的催化位點(diǎn)，受N-myc的抑制。NDRG1位于人染色體8q24，全長(zhǎng)約60kb，包含著16個(gè)外顯子及15個(gè)內(nèi)含子，C末端包含3段特有的具有10個(gè)親水性氨基酸殘基串聯(lián)重復(fù)序列。基質(zhì)金屬蛋白酶作為蛋白水解酶家族，在腫瘤形成微環(huán)境中起到重要作用。

本研究采用siRNA轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC-1細(xì)胞株，經(jīng)Westernblot及qRT-PCR在蛋白及mRNA水平證明沉默效率達(dá)到60%以上，成功的下調(diào)了NDRG1在PAN-1細(xì)胞中的表達(dá)。NDRG1下調(diào)后，經(jīng)Westernblot及qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MMP-7在蛋白及mRNA水平表達(dá)下調(diào)[10]。NDRG1對(duì)惡性腫瘤生長(zhǎng)分化等惡性行為的調(diào)控可能通過調(diào)控MMP-7表達(dá)實(shí)現(xiàn)，MMP-7可與NDRG1的輔基酰基載體蛋白結(jié)合形成復(fù)合體從而影響惡性腫瘤的行為，NDRG1也可能上調(diào)MMP-7表達(dá)從而通過水解活性促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫落、遷移，在遠(yuǎn)隔器官種植浸潤(rùn)。MMP-7以酶原形式產(chǎn)生，激活后即形成IV型膠原酶，從而降解、破壞靠近腫瘤表面細(xì)胞外基質(zhì)中I型、III型膠原，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞沿缺失的基膜環(huán)形侵潤(rùn)，結(jié)果即為惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[18]。MMP-7可以與NDRG1的輔基酰基載體蛋白結(jié)合，兩者以復(fù)合體形式存在并激活，從而影響胰腺癌的生長(zhǎng)分化、凋亡增殖等惡性行為。

MTT顯示，siNDRG1干擾后PANC-1細(xì)胞增殖能力受到抑制，在72、96、120h均低于空白對(duì)照組，NDRG1表達(dá)下調(diào)后PANC-1細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，流式細(xì)胞檢測(cè)也顯示，siNDRG1干擾后PANC-1細(xì)胞凋亡率升高，并以早期凋亡為主，NDRG1過表達(dá)可能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)其進(jìn)行敲除后胰腺癌細(xì)胞凋亡增加。NDRG1通過與靶基因3''''端非翻譯區(qū)的不完全配對(duì)抑制靶基因mRNA的翻譯或降解，從而參與細(xì)胞分化、增殖、發(fā)育、凋亡、代謝生物過程[19]。NDRG1對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控作用可能與對(duì)MMP-7表達(dá)的調(diào)控密切相關(guān)，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。本研究顯示，NDRG1表達(dá)上調(diào)對(duì)胰腺癌細(xì)胞的分化、增殖及凋亡具有調(diào)控作用。NDRG1對(duì)胰腺癌細(xì)胞的調(diào)控作用可能通過MMP-7表達(dá)實(shí)現(xiàn)。本研究可能為胰腺癌治療提供新的靶點(diǎn)，為胰腺癌的治療提供新的思路。

作者：張小薄高峰譚曉冬周磊王懷濤石剛單位：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院普通外科遼寧省腫瘤醫(yī)院大腸外科