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1材料與方法

1．1實驗方法

1．1．1MTT法檢測華蟾素對宮頸癌HeLa細胞生長的影響根據(jù)參考文獻提供方法［6－7］，將宮頸癌HeLa細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調(diào)整其細胞密度后接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，200μl／孔，分組為：調(diào)零孔組（只含RPMI1640培養(yǎng)液，無細胞）、對照組（含RPMI1640培養(yǎng)液、細胞）、華蟾素組（濃度分別為1、10、100、1000μg／ml），待細胞貼壁后加入藥物，其中對照組加入等體積的培養(yǎng)液，然后置于細胞箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后棄掉上清，加入MTT（5mg／ml）20μl／孔，繼續(xù)于細胞培養(yǎng)箱中培育4h后，每孔加入200μlDMSO，在振蕩器上震蕩使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度值（OD，其中波長為570nm），按以下公式計算細胞的增殖抑制率：抑制率＝（1－實驗組平均OD值／對照組平均OD值）×100％。

1．1．2流式細胞術(shù)檢測華蟾素對宮頸癌HeLa細胞周期的影響宮頸癌HeLa細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將細胞用胰酶消化后，重新接種，分組同步驟1．3．1，其中藥物組每組加入華蟾素（濃度分別為1、10、100、1000μg／ml），對照組加入等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后收集細胞，用固定液固定細胞過夜后，離心棄上清，PBS洗滌，用含0．1％TritonX－100、50μg／mlRNAse的PBS混合液將細胞重懸，加入90μlPI（0．5mg／ml）避光孵育半小時后，用尼龍網(wǎng)過濾，然后流式細胞儀進行檢測分析。

1．1．3劃痕實驗檢測華蟾素對宮頸癌HeLa細胞侵襲能力的影響根據(jù)參考文獻劃痕實驗方法［8］，將宮頸癌HeLa細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，分組為：對照組以及藥物華蟾素組（10、100、1000μg／ml）。將細胞于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用20μl加樣槍頭于細胞層中豎向劃一寬度均勻、一致的細胞傷口模型，每孔劃3條傷口，然后藥物組加入含有相應(yīng)濃度的華蟾素培養(yǎng)液，而對照組加入等體積培養(yǎng)液，分別在細胞培養(yǎng)箱中孵育0、24、48h后，于光學(xué)顯微鏡下測算各劃痕的寬度（每條劃痕各取3個固定位置計算距離，取其平均值）。細胞遷移能力以遷移率表示：細胞遷移率＝（原劃痕寬度－現(xiàn)劃痕寬度）／原劃痕寬度×100％。

1．2統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計軟件分析，所有數(shù)據(jù)均用（珋x±s）表示，行單因素方差分析、重復(fù)測量方差分析以及t檢驗。

2結(jié)果

2．1華蟾素抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖MTT法測定結(jié)果示：當(dāng)1、10、100、1000μg／ml華蟾素作用于宮頸癌HeLa細胞24、48、72h后，可見細胞生長顯著變緩。且隨著華蟾素藥物濃度的增加以及作用時間的延長，這種抑制作用有增強趨勢，具有時間、劑量效應(yīng)關(guān)系，各藥物組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。

2．2華蟾素對宮頸癌HeLa細胞周期的影響流式細胞術(shù)結(jié)果示：當(dāng)1、10、100、1000μg／ml華蟾素作用于宮頸癌HeLa細胞48h后，與對照組相比較，華蟾素各濃度組G0／G1期細胞所占比例不斷增加，S期細胞比例減少，G2／M期細胞比例無顯著變化，各藥物組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。

2．3華蟾素抑制宮頸癌HeLa細胞的遷移細胞劃痕實驗結(jié)果示：當(dāng)10、100、1000μg／ml華蟾素作用于宮頸癌HeLa細胞24、48h后，劃痕寬度均大于對照組，通過上述公式計算各組細胞的遷移率發(fā)現(xiàn)：華蟾素組作用于宮頸癌HeLa細胞24、48h后，遷移率均小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），見表3。顯示藥物華蟾素對宮頸癌HeLa細胞的遷移有一定的抑制作用，能夠降低宮頸癌HeLa細胞向遠處轉(zhuǎn)移的能力。

3討論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)中醫(yī)藥材逐漸成為當(dāng)今治療腫瘤的重要手段以及新的策略之一，中藥材的優(yōu)勢主要在于不僅對腫瘤具有顯著的抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性，且對機體的損傷以及不良反應(yīng)小。因此，研究中藥材抗腫瘤效應(yīng)具有廣闊的臨床應(yīng)用價值。華蟾素系傳統(tǒng)中藥中華大蟾蜍皮的水制劑，其主要成分是蟾毒靈及吲哚生物堿等，具有消炎、止痛、抗腫瘤以及提高宿主免疫力等多種作用。近年來研究表明，華蟾素對如乳腺癌、骨肉瘤、前列腺癌等多種腫瘤細胞具有抑制作用并可誘導(dǎo)其凋亡。且動物實驗顯示華蟾素具有升白細胞的作用，具有安全有效、不良反應(yīng)小的優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的輔助治療。但是其對于宮頸癌的作用還未見有相關(guān)文獻報道，因此，我們進行了相關(guān)研究，希望為華蟾素在宮頸癌的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

本實驗用不同濃度的華蟾素作用于宮頸癌HeLa細胞后，通過MTT法觀察發(fā)現(xiàn)，華蟾素作用于宮頸癌HeLa細胞后，可顯著抑制細胞的生長，且對細胞的抑制作用隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長而逐漸增強，這說明華蟾素對HeLa細胞生長的抑制作用具有一定的量效、時效性，表明華蟾素可顯著抑制HeLa細胞的增殖。我們通過流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度華蟾素作用于宮頸癌HeLa細胞48h后，華蟾素各濃度組將細胞周期主要阻滯在G0／G1期，使細胞S期所占比例明顯減少，從而抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖。而有研究顯示，華蟾素能將腫瘤細胞阻斷在S期，從而抑制腫瘤的增殖。這表明華蟾素能夠通過阻滯細胞周期的進展進而發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)，但對不同類型腫瘤細胞周期的具體機制還有待深入的研究和探討。另外，華蟾素還可抑制宮頸癌HeLa細胞的遷移能力。

綜上所述，我們通過細胞增殖、細胞周期及侵襲這些生物學(xué)行為的研究初步證明了華蟾素對宮頸癌HeLa細胞生長的影響，為中藥化療研究提供了新的思路和相應(yīng)的實驗依據(jù)，但是對于華蟾素抗腫瘤作用的具體機制等還有待更進一步的深入研究，為華蟾素發(fā)揮其抗腫瘤作用提供相應(yīng)基礎(chǔ)。

作者：黃美華朱晨宇商遠方單位：恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院婦產(chǎn)科三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院胃腸外科