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本文作者：李崇輝葉晟張愛(ài)群徐鴻濱潘可董家鴻黃志強(qiáng)單位：解放軍總醫(yī)院全軍肝膽外科研究所北京

不同原因引起的肝內(nèi)外膽管梗阻可引起膽源性肝纖維化。過(guò)去20年對(duì)于肝纖維化的研究主要集中于肝星狀細(xì)胞(HSC)，活化的HSC可分泌纖維基質(zhì)成分。近年來(lái)有研究提示，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞可通過(guò)上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)促進(jìn)膽源性肝纖維化[1]。國(guó)外對(duì)原發(fā)性膽汁性肝硬變和原發(fā)性硬化性膽管炎病人的臨床病理標(biāo)本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些病人肝組織中，膽管細(xì)胞可表達(dá)Vimentin、FSP1和Snail等，并且與TGF-β信號(hào)通路的活化相關(guān)，特別是在伴隨膽小管增生時(shí)，但未發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞發(fā)生EMT[2-4]。本研究以經(jīng)典的大鼠膽管結(jié)扎(bileductligation，BDL)后肝內(nèi)膽汁淤積所致肝纖維化為模型，分析膽汁性肝纖維化時(shí)膽管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的特點(diǎn)。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑雄性Wistar大鼠，質(zhì)量200g左右，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。E-cadherin(H-108)兔多抗購(gòu)自SantaCruz公司，抗Vimentin小鼠單抗購(gòu)自Millpore公司，小鼠抗人CK19單抗(CloneMNF116)及α-SMA小鼠單抗購(gòu)自Dako公司，兔抗人FSP1/S100A4多克隆抗體為Invitrogen公司分裝。其他免疫組化學(xué)及免疫熒光所用試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2模型制作大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(50mg/kg，ip)麻醉，沿腹正中線切開(kāi)，暴露膽總管，遠(yuǎn)近端結(jié)扎后中間剪斷，關(guān)腹。假手術(shù)組僅開(kāi)腹并游離膽總管后關(guān)腹。分別于術(shù)后1周和2周時(shí)將大鼠處死，取肝組織進(jìn)行石蠟切片和冷凍切片。膽管結(jié)扎組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=5，假手術(shù)組n=3。

3常規(guī)病理學(xué)觀察石蠟切片經(jīng)HE染色，光鏡下觀察肝小葉、門(mén)管區(qū)的膽管增生、纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

4免疫組化檢測(cè)將切片脫蠟，復(fù)水，3%H2O2處理10min，根據(jù)一抗說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行抗原修復(fù)。1%BSA-PBS封閉30min，加入稀釋后的一抗，于濕盒中室溫孵育2h或4℃過(guò)夜，PBS洗滌3次。然后加入Polymer-horseradishperoxidase(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。光鏡下觀察棕黃色陽(yáng)性信號(hào)的分布特點(diǎn)，以SONY三晶片高清晰CCD及Image-Pro軟件進(jìn)行圖像采集。

5雙標(biāo)記免疫熒光檢測(cè)冷凍組織切片經(jīng)冷丙酮固定10min，PBS洗滌2次，1%BSA-PBS封閉30min。將切片同時(shí)與小鼠抗Vimentin單抗和兔抗E-cadherin多抗孵育，然后以不同熒光素標(biāo)記的二抗檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，即用TRITC-標(biāo)記的山羊抗兔二抗和FITC-標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗同時(shí)孵育，DAPI染核，抗熒光衰減封片劑封片。尼康熒光顯微鏡觀察結(jié)果并照相。

結(jié)果

1HE染色膽管結(jié)扎組大鼠1周后耳、尾等部位皮膚黃染明顯，體重?zé)o明顯差異。假手術(shù)組大鼠肝臟顯示正常肝小葉結(jié)構(gòu)，膽管結(jié)扎組術(shù)后1周匯管區(qū)膽管細(xì)胞增生，呈花環(huán)狀；2周時(shí)膽管增生范圍擴(kuò)大，匯管區(qū)間質(zhì)細(xì)胞明顯增多，發(fā)生纖維化(圖1)。部分匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。膽管結(jié)扎組小葉內(nèi)還可見(jiàn)局灶性肝細(xì)胞壞死區(qū)域。

2免疫組織化學(xué)染色CK19(Cytokeratin19)是膽管上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白。假手術(shù)組大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)正常，每個(gè)匯管區(qū)含有2-5個(gè)棕染的膽小管。膽管結(jié)扎后1周，肝組織匯管區(qū)CK19陽(yáng)性的小膽管樣上皮細(xì)胞明顯增多，常由3-5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞組成花環(huán)樣細(xì)胞團(tuán)，有些細(xì)胞團(tuán)內(nèi)可見(jiàn)小管腔。2周后呈陽(yáng)性染色的膽管細(xì)胞數(shù)量增加更多，并向小葉內(nèi)浸潤(rùn)(圖2)。

3間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志免疫組化染色Vimentin和FSP1/S100A4是間質(zhì)成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，α-SMA是間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志。假手術(shù)組大鼠肝組織Vimentin表達(dá)陰性，膽管結(jié)扎1周時(shí)，肝組織匯管區(qū)內(nèi)新生膽小管Vimentin呈強(qiáng)陽(yáng)性，2周時(shí)除膽管細(xì)胞陽(yáng)性外，匯管區(qū)其他細(xì)胞也表達(dá)Vimentin(圖3)。假手術(shù)組大鼠肝組織內(nèi)FSP1/S100A4陽(yáng)性的細(xì)胞呈散在分布，可能為淋巴細(xì)胞和Kuffer細(xì)胞，膽管結(jié)扎1周和2周時(shí)的大鼠肝組織膽管細(xì)胞呈FSP1/S100A4中度陽(yáng)性表達(dá)(圖4)。但是兩組大鼠膽管細(xì)胞均不表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA，α-SMA陽(yáng)性的細(xì)胞除動(dòng)脈壁外，主要分布于匯管區(qū)，緊密包繞于膽管細(xì)胞周圍(圖5)。

4免疫熒光雙染膽管上皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Vimentin(圖6)。

討論

從上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程被稱作上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)[5]。而相反的轉(zhuǎn)變稱為間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變(MET)。EMT在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有十分重要的地位，現(xiàn)在越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明該過(guò)程在調(diào)控正常人體組織和腫瘤組織的細(xì)胞可塑性方面也起到了關(guān)鍵作用。成熟上皮細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物，如細(xì)胞角蛋白(cytokeratin)、上皮鈣粘素(E-cadherin)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)等表達(dá)下調(diào)或丟失，出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如波形蛋白(Vimentin)、纖維母細(xì)胞特異蛋白-1(fibroblastspecificprotein1，F(xiàn)SP1，又稱為S100A4)和平滑肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)等。

我們?cè)谀懝芙Y(jié)扎誘導(dǎo)的膽源性肝纖維化大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)門(mén)管區(qū)的膽管細(xì)胞不僅表達(dá)CK19，也表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin和FSP1。波形蛋白是細(xì)胞骨架蛋白的一種，是間質(zhì)來(lái)源細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，F(xiàn)SP1是早期成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志蛋白，能夠通過(guò)與細(xì)胞骨架和p53蛋白的C末端反應(yīng)而改變細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和生長(zhǎng)。在EMT發(fā)生的起始階段，由于FSP1很快被誘導(dǎo)表達(dá)，可在原位鑒定到發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞[6-7]。這些結(jié)果表明肝內(nèi)膽汁淤積誘導(dǎo)膽汁性纖維化時(shí)，匯管區(qū)膽管在增生的同時(shí)，發(fā)生了向間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)變。由于間質(zhì)表型細(xì)胞在功能上十分活躍，細(xì)胞黏附力下降，遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，還可分泌多種細(xì)胞因子，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式作用于鄰近細(xì)胞，以加速纖維化進(jìn)程[6]。但是BDL大鼠膽管上皮并不表達(dá)α-SMA，可能是由于在體內(nèi)EMT標(biāo)志并不像在體外那樣所有的標(biāo)志都能體現(xiàn)出來(lái)，例如I型膠原合成只在某些成纖維細(xì)胞亞群中表現(xiàn)出來(lái)，α-SMA只在肌成纖維細(xì)胞表達(dá)，而且FSP1+的細(xì)胞不表達(dá)α-SMA。

目前的研究還不能確定發(fā)生EMT的膽管細(xì)胞是通過(guò)直接轉(zhuǎn)化為纖維基質(zhì)生成細(xì)胞，還是通過(guò)活化其他類型細(xì)胞間接參與肝纖維化。最近有研究[8]利用YFP和CK19標(biāo)記的小鼠膽管細(xì)胞進(jìn)行示蹤研究，發(fā)現(xiàn)肝纖維化時(shí)膽管細(xì)胞并未轉(zhuǎn)變成α-SMA陽(yáng)性肌成纖維細(xì)胞或FSP1陽(yáng)性成纖維細(xì)胞，但是該研究未檢測(cè)膽管細(xì)胞的Vimentin表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞膠原合成增加，致纖維化因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)和促間質(zhì)生長(zhǎng)因子Hh(Hegehog)配體、PDGF-BB等分泌增加，因而可對(duì)門(mén)管區(qū)成纖維細(xì)胞起到促進(jìn)作用。因此間質(zhì)表型的膽管上皮細(xì)胞可能主要通過(guò)分泌細(xì)胞外基質(zhì)和致纖維化因子促進(jìn)其他間質(zhì)細(xì)胞的增生。

膽管增生(膽小管反應(yīng))被認(rèn)為在膽源性肝纖維化的啟動(dòng)和發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[9]。BDL大鼠中增生膽管細(xì)胞發(fā)生EMT，那么EMT和膽管細(xì)胞增生之間關(guān)系如何？膽管細(xì)胞增生受到許多因素的調(diào)節(jié)，如胃腸激素、膽酸、生長(zhǎng)因子(如EGF、HGF)、血管生成因子(如VEGF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子(如IL-6)等均可刺激膽管細(xì)胞增生，這些因子與膽管細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變的關(guān)系及分子機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。