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摘要目的摘要：探索口腔扁平苔蘚（OLP）中Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表達意義及其和細胞凋亡的關系.方法摘要：采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的原位缺口末端標記法（TUNEL法）、SP免疫組化方法檢測33例OLP及7例正常口腔黏膜（對照組）中Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表達及細胞凋亡情況.結果摘要：OLP中上皮細胞凋亡指數（AI）明顯高于正常對照組(P%26lt;0.05)，而固有層的AI明顯低于正常對照組(P%26lt;0.05).OLP的上皮層和固有層Caspase3陽性表達明顯高于正常對照組(P%26lt;0.025).OLP中上皮層TNFRI及固有層TNFα陽性表達明顯高于正常對照組(P%26lt;0.025)，而上皮層TNFα及固有層TNFRI陽性表達則明顯低于正常對照組(P%26lt;0.025)，糜爛型組固有層中TNFα陽性表達明顯高于非糜爛型組(P%26lt;0.05).OLP上皮層Caspase3陽性表達和其自身AI呈正相關（r=0.631,P%26lt;0.05）,而固有層淋巴細胞Caspase3陽性表達和自身的AI無相關性(P%26gt;0.05)；TNFα/TNFRI表達和OLP上皮及固有層細胞的AI密切相關.結論摘要：OLP中同時存在角質細胞凋亡亢進及固有層淋巴細胞凋亡的減少，這種凋亡的異常可能和OLP的發生發展密切相關.

【扁平苔癬，口腔；Caspase3；腫瘤壞死因子；TNFRΙ；細胞凋亡

0引言

口腔扁平苔蘚（orallichenplanus,OLP）是臨床上常見的口腔黏膜非感染性疾病，在臨床上主要表現為口腔黏膜的白色斑塊或條紋，其病理特征為上皮下固有層淋巴細胞帶狀浸潤及基底層細胞液化變性.OLP的發病機制尚無定論.近期探究表明，OLP為細胞介導的自身免疫性疾病，且和細胞凋亡異常相關［1］.我們通過原位檢測OLP中Caspase3,TNFα和TNFRΙ蛋白的表達及細胞凋亡情況，探索Caspase3,TNFα和TNFRΙ在OLP發生發展中的功能及其和細胞凋亡的關系.

1對象和方法

1.1對象收集廣州暨南大學第一附屬醫院及廣東省口腔醫院2001/2004年間口腔門診OLP患者活檢標本33（男7，女26）例，均是2mo內未經激光、激素、免疫調節治療的原發病例.患者年齡22～71（平均45）歲.16例取自舌部黏膜，14例取自頰黏膜，3例取自下唇黏膜.非糜爛型24例，糜爛型9例.另取7例因口腔外傷或整形手術切除的正常黏膜作為對照組.根據臨床表現結合HE染色，按WHO的OLP病理診斷標準，由兩位臨床病理醫師分別獨立診斷，以兩人一致的結果為最終判定.根據臨床表現結合病理診斷，將33例OLP分為2組摘要：糜爛型9例，非糜爛型24例.試劑摘要：小鼠抗人Caspase3mAb（濃縮型）購自NeoMarkers公司，工作濃度是1∶50.小鼠抗人TNFα和TNFRImAb（濃縮型）購自SantaCruz公司，工作濃度分別是1∶400及1∶100.TUNEL試劑盒為基因公司產品.SP試劑盒、DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術開發公司.

1.2方法患者活檢標本4μm厚連續石蠟切片，65℃烘烤，脫蠟、水化后微波修復抗原，免疫組化SP法檢測目標抗原,從33例OLP中隨機選取15例（將33例隨機編號，取偶數，末例舍去），TUNEL法原位檢測15例OLP和全部正常黏膜的凋亡細胞.SP法操作步驟嚴格按照SP試劑盒說明書進行，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，PBS代替一抗作為替代對照，用已知陽性片做陽性對照.TUNEL法操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，DAB顯色，PBS替代TUNEL反應液作替代對照.

1.2.1免疫組織化學染色Caspase3陽性染色為細胞質或（和）細胞核內棕黃色顆粒著色，TNFα和TNFRΙ陽性染色均為細胞質中棕黃色顆粒著色.隨機選擇5個高倍視野（×400），計數陽性細胞所占的百分比.根據陽性細胞的比例記分摘要：陽性細胞比例為0，記為0分；1%～25%，記為1分；26%～50%，記為2分；%26gt;50%，記為3分.

1.2.2凋亡細胞的原位檢測細胞核呈棕褐色或細胞質因核DNA逸出至陽性染色者，為凋亡細胞，隨機選擇5個高倍視野（×400），計數凋亡細胞數百分率,即為凋亡指數(apoptosisindex,AI).

統計學處理摘要：全部數據用SPSS10.0統計軟件進行分析，Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表達結果采用非參數等級資料秩和檢驗MannWhitneyTest，檢驗水準取雙側α=0.025（因涉及2次重復比較新問題，故調整檢驗水準，α=α/2,α取0.05）.TUNEL法實驗結果采用兩樣本均數比較的t檢驗.AI和Caspase3,TNFα和TNFRΙ表達的相關性及TNFα和TNFRΙ之間表達的相關性，采用Spearman等級相關分析.

2結果

2.1細胞凋亡情況在口腔黏膜上皮層及固有層均可見凋亡細胞，核呈棕褐色，輪廓清楚、致密.經兩樣本均數比較的t檢驗（經方差齊性檢驗,各組間總體方差齊同），OLP中上皮細胞凋亡指數明顯高于正常對照組（P%26lt;0.05），凋亡細胞多位于基底層或基底上層，而正常對照組中的凋亡細胞多位于表層及棘層.口腔扁平苔蘚中固有層的細胞凋亡指數明顯低于正常對照組（P%26lt;0.05），凋亡細胞多位于固有層深層（圖1A，表1）.

表1口腔扁平苔蘚和正常對照組中細胞凋亡指數的比較（略）

aP%26lt;0.05vs正常黏膜組.

2.2Caspase3表達情況OLP中Caspase3的陽性率上皮層和固有層均為100%，上皮層主要表達于基底細胞和棘細胞的胞質，亦可見胞核著色，基底細胞層及近基底細胞層陽性細胞為中度陽性表達，棘細胞層陽性細胞為弱陽性表達(圖1B);固有層近基底膜的淋巴細胞和部分炎性細胞胞質和胞核均呈強陽性或中度表達.正常組上皮層陽性率為100%，均為弱表達；固有層陽性率為28.6%(2/7)，為個別細胞弱陽性表達.和正常組相比，OLP患者上皮層角化細胞和固有層淋巴細胞表達Caspase3明顯增強（P%26lt;0.025，表2）.

表2口腔扁平苔蘚和正常對照組中Caspase3的表達水平（略）

aP%26lt;0.025vs正常黏膜組.上皮層，固有層分別指上皮層角化細胞和固有層淋巴細胞.

2.3TNFα和TNFRΙ表達情況OLP的TNFα陽性表達率是75.8%（25/33），其中上皮層和固有層都有表達者14例，僅上皮層表達者3例，僅固有層表達者8例，但上皮層和固有層的陽性表達率各有不同.OLP組TNFα的上皮層陽性表達率51.5%（17/33）明顯低于正常對照組的陽性表達率100%（7/7）（P%26lt;0.025），而OLP組的TNFα固有層的陽性表達率66.7%（22/33）明顯高于正常對照組的陽性表達率0.0%（0/7）（P%26lt;0.025），糜爛型組固有層中TNFα表達明顯高于非糜爛型組（P%26lt;0.05,表3）.TNFα陽性染色主要彌漫分布于胞質，陽性細胞呈彌散性分布.上皮層陽性細胞主要分布于基底層及棘層（圖1C）.固有層中主要是圍繞上皮釘突浸潤的淋巴細胞呈陽性表達，大多數正常對照組上皮層細胞中TNFα強陽性表達，而固有層細胞中無表達.

OLP中TNFRI的陽性表達率是48.5%（16/33），其中上皮層和固有層都有表達者為9例，僅上皮層有表達者6例，僅固有層有表達者1例，但上皮層和固有層的陽性表達率各有不同.OLP組的TNFRI的上皮層陽性表達率45.5%（15/33）明顯高于正常對照組的0.0%（0/7）（P%26lt;0.025），而固有層陽性表達率30.3%（10/33）明顯低于正常對照組的85.7%（6/7）（P%26lt;0.025,表3）.TNFRI陽性染色主要定位于細胞質，陽性細胞局限于上皮基底層，呈帶狀分布；固有層的淋巴細胞呈陽性，散在分布（圖1D）.

表3口腔扁平苔蘚和正常對照組中的TNFα和TNFRΙ的表達水平（略）

aP%26lt;0.025vs正常黏膜組,bP%26lt;0.05vs非糜爛型組.

2.4OLP中Caspase3,TNFα和TNFRΙ的表達和細胞凋亡的關系OLP上皮細胞Caspase3陽性表達強弱和上皮細胞的AI呈正相關（r=0.631,P%26lt;0.05），固有層淋巴細胞Caspase3的陽性表達強弱和其自身的AI無相關性（P%26gt;0.05）.TNFα/TNFRI和OLP上皮層及固有層細胞的AI有相關性，SpearmanA摘要：口腔扁平苔蘚中固有層淋巴細胞中可見胞核被染成棕黃色的凋亡細胞TUNEL×400；B摘要：口腔扁平苔蘚上皮層基底細胞Caspase3表達陽性SP×400；C摘要：口腔扁平苔蘚上皮細胞胞質TNFα陽性表達SP×400；D摘要：口腔扁平苔蘚固有層淋巴細胞胞質TNFRI陽性表達SP×400.

圖1口腔扁平苔蘚中TUNEL法陽性染色及Caspase3,TNFα和TNFRI蛋白的陽性表達（略）

等級相關分析顯示OLP固有層淋巴細胞TNFα陽性表達和上皮細胞的AI呈正相關（r=0.971,P%26lt;0.05），和其自身的凋亡則呈負相關（r=-0.533,P%26lt;0.05）.OLP上皮細胞TNFRI陽性表達和上皮細胞的AI呈正相關（r=0.583,P%26lt;0.05）；固有層淋巴細胞TNFRI陽性表達和其自身的AI呈正相關（r=0.699,P%26lt;0.05）.

3討論

OLP為細胞介導的自身免疫性疾病，病變的發生發展和細胞凋亡異常相關［1］.本實驗結果顯示，OLP上皮細胞的凋亡指數比正常對照組高，和Hirota等［2］報道的結果一致.凋亡的上皮細胞多分布于萎縮型的OLP，這可能是因為大量上皮細胞的凋亡導致了上皮層的萎縮、變薄，提示OLP上皮萎縮的改變可能和凋亡相關；同時觀察到在凋亡的上皮細胞較密集的OLP病例，多出現較明顯的基底細胞液化變性，故推測OLP基底層上皮細胞的液化變性和凋亡有關.而觀察到OLP固有層淋巴細胞的凋亡指數比正常對照組有所降低則提示OLP固有層中淋巴細胞的凋亡受到抑制，細胞不能經歷正常的凋亡過程而聚集在OLP的固有層中.

Caspase家族是細胞發生凋亡的關鍵酶類，Caspase3是最重要的效應型Caspase.本探究結果表明，OLP患者口腔黏膜上皮表達Caspase3明顯增強（P%26lt;0.05），提示OLP中Caspase家族的級聯反應是在OLP上皮層的生發層內被激活的，胞核陽性表達是由于在細胞成熟、衰老、死亡時，Caspase3從胞質易位到胞核.

Nakagawara等［3］在退化凋亡神經母細胞瘤中報道了相似情況，由此推測胞核中的Caspase3可能和細胞凋亡有關，但具體機制不清.實驗結果分析還提示，Caspase3在OLP上皮層細胞凋亡中起重要功能；而固有層淋巴細胞的生命活動更為復雜，TNFαTNFRI通路可能不僅僅介導細胞凋亡.

腫瘤壞死因子（TNF）是由于其能引起腫瘤組織出血性壞死而得名，TNFα和TNFRI和相關分子結合，激活Caspase3而最終導致靶細胞凋亡［4］.Erdem等［5］檢測到OLP患者血清中的TNFα水平明顯比正常對照組高，SimarkMattsson等［6］發現OLP的T細胞有TNFαmRNA的表達.本探究結果提示，OLP上皮細胞的凋亡異常可能是通過TNFαTNFRI介導的凋亡通路實現的，OLP固有層中的淋巴細胞表達TNFα，通過結合上皮細胞表面的TNFRI誘導上皮細胞凋亡；OLP固有層淋巴細胞的凋亡可能也是由TNFαTNFRI介導實現的，但是由于TNFRI表達的減少，導致TNFα沒有足夠的受體結合而不能正常發揮功能，抑制了細胞凋亡，這也說明靶細胞表面TNFRI的質和量直接影響TNFα的敏感性.沈麗佳等［7-8］的探究結果表明，OLP中的上皮細胞和固有層淋巴細胞都是TNFα潛在來源，當OLP中上皮細胞表達TNFα及固有層淋巴細胞表達TNFRI減少時，TNFαTNFRI介導淋巴細胞的凋亡途徑受阻，淋巴細胞得以“逃逸”正常的凋亡而聚集于OLP的固有層中.本實驗中，OLP固有層淋巴細胞TNFα的表達還和其自身的AI呈負相關，因為TNFα和受體結合后，介導的不止是凋亡通路，還有可能激活NFκB通路，從而產生有利于細胞生存的信號，導致細胞增殖.這也說明了TNFαTNFRI細胞信號傳導通路的復雜性，其選擇死亡或生存信號的機制有待進一步探索.

本探究中糜爛型OLP固有層淋巴細胞TNFα的表達明顯高于非糜爛組，說明TNFα在OLP中除了誘導上皮細胞的凋亡外，還可能通過抑制細胞的生長或通過細胞毒功能，損傷上皮細胞，導致臨床上出現上皮萎縮、糜爛等表現.TNFα表達的高低對于OLP臨床診斷及治療的指導意義還有待進一步探索.