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中國(guó)藥用真菌資源豐富,是世界上使用藥用真菌治病最早的國(guó)家之一,靈芝、茯苓、豬苓和雷丸等藥用真菌在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就已被分別列項(xiàng)論述,這些藥物至今仍沿用不衰。藥用真菌大多屬于囊菌亞門(mén)、擔(dān)子菌亞門(mén)和半知菌亞門(mén)。中國(guó)已報(bào)道的食用菌近1000種,人工栽培種類近70種。有藥用價(jià)值的真菌有300多種,而迄今真正作為藥物使用的只有20~30種,是大型真菌種類中的極少部分。發(fā)酵工程是指采用工程技術(shù)手段,利用生物(主要是微生物)和有活性的離體酶的某些功能,為人類生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品,或直接用微生物參與控制某些工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程的一種技術(shù)。闡述藥用真菌發(fā)酵水平主要影響因素。

1藥用真菌發(fā)酵主要方式

1.1藥用真菌的固體發(fā)酵

將一種或多種藥用真菌接種到適宜的固體培養(yǎng)基表面,在適宜的培養(yǎng)條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的方法稱為藥用真菌的固體發(fā)酵。古代固體發(fā)酵是中藥炮制的一種方法,中藥通過(guò)發(fā)酵炮制達(dá)到提高藥效、改變藥性、降低毒副作用等目的。神曲、紅曲、淡豆豉和百藥煎等均是通過(guò)傳統(tǒng)固體發(fā)酵而成的中藥,其發(fā)酵方式屬于固態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵方式、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等因素對(duì)發(fā)酵中藥其質(zhì)量產(chǎn)生重要影響。參與發(fā)酵的微生物類群有多種菌種,其中霉菌是微生物發(fā)酵的主要功能菌群。古代固體發(fā)酵屬于自然發(fā)酵,發(fā)酵條件不好控制,所以中藥質(zhì)量的高低也存在一定的波動(dòng)。在培養(yǎng)條件方面,中藥炮制人員在長(zhǎng)期發(fā)酵炮制中藥的生產(chǎn)活動(dòng)中積累了較為豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),但受當(dāng)時(shí)科學(xué)技術(shù)發(fā)展水平的限制,溫度和濕度等培養(yǎng)條件參數(shù)的控制無(wú)法準(zhǔn)確控制,所以在中藥的發(fā)酵炮制過(guò)程培養(yǎng)條件控制方面有較大的主觀性。中藥的發(fā)酵炮制在發(fā)酵菌種、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等方面都難于客觀地準(zhǔn)確控制。因此,經(jīng)傳統(tǒng)固體發(fā)酵炮制的中藥其質(zhì)量的穩(wěn)定性難于保證。從20世紀(jì)60年代起,篩選適合的藥用真菌發(fā)酵工程菌,以富含碳、氮及礦物質(zhì)等各種營(yíng)養(yǎng)成分的農(nóng)副產(chǎn)品作為發(fā)酵培養(yǎng)基,在無(wú)菌條件下將活化的單一藥用真菌工程菌接種到滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基上,控制培養(yǎng)條件進(jìn)行固體發(fā)酵。與傳統(tǒng)固體發(fā)酵相比,現(xiàn)代固體發(fā)酵工藝更易于控制。

1.2藥用真菌的液體發(fā)酵

通過(guò)對(duì)藥用真菌發(fā)酵工藝的控制,使藥用真菌在最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)條件等最優(yōu)條件下生長(zhǎng),呼吸作用所產(chǎn)生的代謝廢氣又能及時(shí)排放,新陳代謝旺盛,在短期內(nèi)能獲得大量的菌絲體和富含自身次生代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液。針對(duì)藥用真菌的單菌種液體發(fā)酵的研究已成為研究的熱點(diǎn)。靈芝、冬蟲(chóng)夏草、云芝、竹黃、豬苓、密環(huán)菌和猴頭菌等藥用真菌的液體發(fā)酵都有報(bào)道。邵偉等用液體搖瓶培養(yǎng)探討了茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)的最適培養(yǎng)條件,表明茯苓液體發(fā)酵的最適溫度、搖瓶裝量、搖瓶轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH分別為26℃、150mL/500mL形瓶、100~150r/min、pH5.0~5.5。認(rèn)為茯苓菌絲球直徑一般在0.75~0.80mm時(shí),菌絲體收率較高。

李羿,萬(wàn)德光等探討了茯苓發(fā)酵罐補(bǔ)料液體發(fā)酵的發(fā)酵工藝。在發(fā)酵培養(yǎng)第48、60、72、84h時(shí),分別以0.33%、0.67%、0.67%和0.33%的葡萄糖濃度補(bǔ)料效果最佳,使菌絲干重從10.74g/L增長(zhǎng)到11.95g/L,菌體產(chǎn)量提高率達(dá)11.27%。同時(shí),使發(fā)酵時(shí)間從168h縮短為120h。結(jié)果表明,單一酵母膏或蛋白胨均不適宜于靈芝的生長(zhǎng),而含有酵母膏0.5%和蛋白胨0.5%的復(fù)合氮源則適宜于靈芝的生長(zhǎng)。初始葡萄糖濃度在2.0%~6.5%內(nèi),其濃度大小對(duì)靈芝的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生物合成將產(chǎn)生較大影響。較高初始濃度葡萄糖將有利于靈芝胞外多糖產(chǎn)量的提高。當(dāng)初始葡萄糖濃度為5%時(shí),靈芝生物量可高達(dá)16.7g/L(干重),胞內(nèi)多糖達(dá)1.19g/L,靈芝酸達(dá)212.3mg/L。

1.3藥用真菌的多菌種混合液體發(fā)酵

藥用真菌液體混合發(fā)酵中由于多種藥用真菌間的協(xié)同效應(yīng)使其能更有效地利用發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)中的纖維素等有機(jī)物質(zhì),解除發(fā)酵降解產(chǎn)物的阻遏效應(yīng)。另外,依賴混合發(fā)酵中多種藥用真菌豐富的酶系,還有望生成新的活性化合物。因?yàn)樗幱谜婢后w混合發(fā)酵較單菌種液體發(fā)酵有更高的生物轉(zhuǎn)化效率所以藥用真菌液體混合發(fā)酵的研究正越來(lái)越受到科研人員的重視。

2藥用真菌的研究

能否選好的藥用真菌是提高發(fā)酵水平高低的關(guān)鍵因素。人們最初是從自然界中篩選所需要的藥用真菌,但利用這種方法得到的藥用真菌的產(chǎn)量一般都比較低。20世紀(jì)40年代后,利用紫外線、激光和化學(xué)誘變劑等物理化學(xué)誘變因素來(lái)處理藥用真菌,使其產(chǎn)生突變,再篩選出符合要求的優(yōu)良藥用真菌。陳石良等以灰樹(shù)花Gr9801為出發(fā)菌株,采用紫外線連續(xù)誘變,經(jīng)分離純化和馴化等方法,以斜面生長(zhǎng)速度和液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)多糖總量為監(jiān)測(cè)指標(biāo),篩選出一株遺傳上相對(duì)穩(wěn)定的適應(yīng)液體培養(yǎng)的灰樹(shù)花菌株GrUv04,該菌株在綜合PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度快,菌體豐滿純白。經(jīng)馴化后在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵生長(zhǎng)力強(qiáng),生物量達(dá)1.97%,發(fā)酵多糖總量達(dá)216mg/100mL,分別較出發(fā)菌株提高129.1%和75.6%。筆者將茯苓孢子懸液經(jīng)紫外線照射后,通過(guò)茯苓優(yōu)良菌種篩選模型篩選得到茯苓優(yōu)良菌株P(guān)6。菌株P(guān)6搖瓶發(fā)酵后每升發(fā)酵液中菌絲體干重達(dá)11.92g/L,較出發(fā)菌株P(guān)0提高了7.58%。菌株P(guān)6傳代培養(yǎng)后進(jìn)行搖瓶液體發(fā)酵,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3藥用真菌培養(yǎng)基的研究

藥用真菌培養(yǎng)基的組成對(duì)其發(fā)酵水平高低有很大的影響。藥用真菌發(fā)酵培養(yǎng)基從最先僅僅是提供藥用真菌生長(zhǎng)代謝所需的碳源、氮源等成分的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基,逐步發(fā)展到采用不同的中藥材為底物組成不同的藥性培養(yǎng)基,或在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中添加具有中藥材活性成分組成復(fù)合培養(yǎng)基。選擇適當(dāng)?shù)闹兴幖尤胨幱谜婢顚影l(fā)酵基質(zhì),中藥中的成分可對(duì)藥用真菌的代謝產(chǎn)物起到增效的作用。

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加中藥成分對(duì)藥用真菌自身的生長(zhǎng)代謝將產(chǎn)生重要的影響。楊海龍,吳天祥等[9]將適量的黃芪、薏苡仁、枸杞子、當(dāng)歸、玄參、山藥、黨參、等提取液添加到靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,研究其對(duì)靈芝液體發(fā)酵的生物量和代謝產(chǎn)物胞外多糖的影響,發(fā)現(xiàn)其中的部分成分可促進(jìn)靈芝的生長(zhǎng)或代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。楊海龍等報(bào)道了以中藥薏苡仁為培養(yǎng)基的靈芝液體發(fā)酵,研究結(jié)果表明最適培養(yǎng)基中薏苡仁的含量為3.59%,薏苡仁可促進(jìn)靈芝的生長(zhǎng)。原因可能是薏苡仁中脂肪酸與靈芝細(xì)胞膜結(jié)合,從而利于靈芝從培養(yǎng)基中攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)靈芝生長(zhǎng)。對(duì)藥性培養(yǎng)基中中藥材底物的選擇及藥性培養(yǎng)基對(duì)藥用真菌發(fā)酵水平影響的研究還有待進(jìn)一步深化。

4討論

藥用真菌發(fā)酵方式、發(fā)酵工程菌和發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)真菌發(fā)酵水平有很大的影響藥。隨著發(fā)酵方式的進(jìn)一步研究,特別是藥用真菌的多菌種混合液體發(fā)酵機(jī)理的深入研究,將大大提高真菌發(fā)酵的水平。上述研究工作的進(jìn)展必將提高中國(guó)藥用真菌的發(fā)酵水平,促進(jìn)中國(guó)藥用真菌在醫(yī)療保健領(lǐng)域發(fā)揮其更大的作用。