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1實驗方法

1.1菌株活化配制CPDA培養(yǎng)基，接種香菇南山1號菌株，28℃培養(yǎng)，待菌株滿管后，4℃冰箱保藏備用。

1.2液體母種的制備配制母種培養(yǎng)基，取香菇南山1號0.5cm2菌塊接種于母種培養(yǎng)基中，靜置24h，28℃、170r/min振蕩培養(yǎng)10d備用。

1.3生物轉(zhuǎn)化量的測定將液體條件下培養(yǎng)好的香菇菌絲體抽濾至不滴水，電子分析天平稱重。

1.4單因素試驗碳源篩選試驗：在碳源篩選培養(yǎng)基中，用10.0g玉米粉分別與麥芽糖、紅糖、蔗糖和葡萄糖各20.0g組合作為碳源，配制培養(yǎng)基，將液體母種按照5%的接種量接種，靜置24h，28℃、160r/min條件下培養(yǎng)10d，每種培養(yǎng)基3個重復(fù)，測定菌絲生物轉(zhuǎn)化量，求平均值，觀察不同碳源對香菇菌絲生長的影響，篩選出最佳碳源組合作為Plackett-Burman設(shè)計考慮因素。氮源篩選試驗：在氮源篩選培養(yǎng)基中，用10.0g麥麩分別與酵母粉、蛋白胨、牛肉粉和NH4NO3各2.0g組合作為氮源，配制培養(yǎng)基，將液體母種按照5%的接種量接種，靜置24h，28℃、160r/min條件下培養(yǎng)10d，每種培養(yǎng)基3個重復(fù)，測定菌絲生物轉(zhuǎn)化量，求平均值，觀察不同氮源對香菇菌絲生長的影響，篩選出最佳氮源組合作為Plackett-Burman設(shè)計考慮因素。

1.5Plackett-Burman設(shè)計試驗根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取11個因素(紅糖、玉米粉、麥麩、牛肉粉、KH2PO4、MgSO4•7H2O、VB1、初始pH、接種量、溫度、振蕩速度)作為研究對象，進行Plackett-Burman設(shè)計試驗，按照表4和表5配制培養(yǎng)基，接液體母種，靜置24h，振蕩培養(yǎng)10d，每組試驗設(shè)3個重復(fù)，將菌絲球抽濾，測定菌絲生物轉(zhuǎn)化量，求平均值，借助Minitab15軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.6最陡爬坡試驗根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，以及各個顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定步長及變化方向進行試驗。針對影響顯著因素進行最陡爬坡試驗，將正效應(yīng)的值逐步增加，負(fù)效應(yīng)的值逐步減小，設(shè)計試驗找出峰值，以尋找快速最佳的響應(yīng)區(qū)域。每種培養(yǎng)基設(shè)3個重復(fù)，接種后靜置24h，振蕩培養(yǎng)10d，將菌絲球抽濾，測定菌絲生物轉(zhuǎn)化量。

1.7Box-Behnken試驗設(shè)計與分析根據(jù)上述試驗，以菌絲生物轉(zhuǎn)化量為響應(yīng)值，采用玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）進行4因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，因素與水平編碼見表1。

1.8數(shù)據(jù)處理與分析采用Minitab15軟件和Excel數(shù)據(jù)分析工具中的t−檢驗(雙樣本異方差假設(shè))對Plackett-Burman試驗結(jié)果進行分析，并采用Design-Expert8.0.6軟件對Box-Behnken試驗結(jié)果進行分析。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1不同碳源對香菇菌絲體生長的影響按照1.2.4方法進行試驗，觀察不同碳源對香菇菌絲生長的影響，結(jié)果見表2。表2結(jié)果表明，不同碳源對香菇菌絲體生長的生物轉(zhuǎn)化量不同，其中以紅糖和玉米粉組合最好，菌絲生物轉(zhuǎn)化量最高。以麥芽糖和玉米粉組合也顯現(xiàn)出較高的生物轉(zhuǎn)化量，葡萄糖和玉米粉組合的菌絲生物轉(zhuǎn)化量最低。根據(jù)不同碳源組合培養(yǎng)基中香菇菌絲的生長狀況和生物轉(zhuǎn)化量,可確定紅糖與玉米粉組合為最佳碳源，菌絲生物轉(zhuǎn)化量為27.322g/L。

2.1.2不同氮源對香菇菌絲體生長的影響按照1.2.4方法進行試驗，觀察不同氮源對香菇菌絲生長的影響，結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明，不同氮源對香菇菌絲體生長的生物轉(zhuǎn)化量不同，其中以牛肉粉和麥麩組合最好，菌絲生物轉(zhuǎn)化量高。以酵母粉和麥麩組合作為氮源也顯現(xiàn)出較高的生物轉(zhuǎn)化量，NH4NO3和麥麩組合的菌絲生物轉(zhuǎn)化量最低。根據(jù)不同氮源組合培養(yǎng)基中香菇菌絲的生長狀況和生物轉(zhuǎn)化量,可確定牛肉粉與麥麩組合為最佳氮源，菌絲生物轉(zhuǎn)化量為30.343g/L。

2.2Plackett-Burman設(shè)計試驗選用試驗次數(shù)n=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計，考察X1(紅糖)、X2(玉米粉)等11個因素，根據(jù)前期試驗結(jié)果，每個因素取兩水平，以菌絲生物轉(zhuǎn)化量Y為響應(yīng)值。同時借助Minitab15軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，并通過t−檢驗從11個因素中選出了4個最顯著影響因素，結(jié)果見表4和表5。表4和表5結(jié)果表明，對香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量影響的顯著因素：玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）。其中，X2、X3和X11在增加的時候，菌絲生物轉(zhuǎn)化量的值明顯增加，為正效應(yīng)因素。而X6在量增多的時候，菌絲生物轉(zhuǎn)化量反而降低，因此X6為負(fù)效應(yīng)因素。

2.3最陡爬坡試驗響應(yīng)面擬合只有在鄰近最大響應(yīng)區(qū)域后才能最好地反映出真實情況，故要先逼近最佳響應(yīng)區(qū)域。根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，將玉米粉（X2）、麥麩（X3）和接種量（X11）的值逐步增加，MgSO4•7H2O（X6）的值逐步減小。根據(jù)Minitab15軟件試驗分析，其他因素取高水平，結(jié)果見表6。表6結(jié)果表明，在玉米粉24.0g/L，麥麩14.0g/L，MgSO4•7H2O1.1g/L，接種量14.0%時，測得香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量最大為29.214g/L，所以此為最佳響應(yīng)區(qū)域。

2.4Box-Behnken試驗設(shè)計與分析按照表1中因素水平，借助Design-Expert8.0.6軟件進行4因素3水平Box-Behnken試驗設(shè)計，結(jié)果見表7。

2.5回歸模型方差分析結(jié)果經(jīng)Design-Expert8.0.6軟件，以玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）為響應(yīng)變量，以菌絲生物轉(zhuǎn)化量（Y）為響應(yīng)值對表7結(jié)果進行處理，得到表8回歸方程方差分析表，利用軟件進行非線性的二次多項式擬合。

2.6響應(yīng)面及等高值分析結(jié)果根據(jù)回歸方程繪制菌絲生物轉(zhuǎn)化量隨各因素變化的響應(yīng)曲面圖，由響應(yīng)曲面圖可知玉米粉、麥麩、MgSO4•7H2O、接種量4個因素對香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量的影響(圖1、圖2)。每個響應(yīng)曲面分別代表著兩個獨立因素間的相互作用，其余兩個因素保持在編碼水平的0水平。圖1結(jié)果顯示，在一定接種量條件下，隨著玉米粉含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢；在玉米粉含量較低條件下，隨著接種量的增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢；在玉米粉含量較高條件下，接種量對香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量影響不明顯。圖2結(jié)果顯示，在低硫酸鎂含量條件下，隨著麥麩含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢；在高硫酸鎂含量條件下，隨著麥麩含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈下降趨勢；在低麥麩含量條件下，隨著硫酸鎂含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢；在高麥麩含量條件下，隨著硫酸鎂含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈下降趨勢。在實際生產(chǎn)過程中，為了降低成本，盡可能使用有機廉價的原料，所以在“criteria”選項中選擇MgSO4•7H2O為最小值，玉米粉、接種量、麥麩為平均值，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量為最大值，利用Design-Expert8.0.6得到香菇南山1號菌株液體種的最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件：玉米粉36.0g、麥麩21.0g、紅糖20.0g、牛肉粉4.0g、KH2PO43.0g、MgSO4•7H2O0.6g、VB110.0mg、H2O1.0L，初始pH6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180r/min振蕩發(fā)酵10d，菌絲生物轉(zhuǎn)化量擬合值為49.956g/L。

2.7驗證試驗根據(jù)最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件參數(shù)對模型進行驗證，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，最終得到香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量為51.004g/L，在初始培養(yǎng)條件下菌絲生物轉(zhuǎn)化量為29.214g/L，優(yōu)化后提高了1.75倍。實測值與擬合值相比，相對誤差約為2.098%。該結(jié)果表明，響應(yīng)面法優(yōu)化香菇液體種最佳生產(chǎn)工藝條件是可行有效的。

3結(jié)論

本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法對香菇南山1號菌株液體種生產(chǎn)工藝條件進行了優(yōu)化，并得到回歸方程，表明玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接種量（X11）對響應(yīng)值均有顯著影響，接種量和玉米粉、麥麩和MgSO4•7H2O交互作用顯著。經(jīng)回歸分析并結(jié)合生產(chǎn)實際，確定香菇南山1號菌株的液體種生產(chǎn)工藝條件為玉米粉36.0g、麥麩21.0g、紅糖20.0g、牛肉粉4.0g、KH2PO43.0g、MgSO4•7H2O0.6g、VB110.0mg、H2O1.0L、初始pH6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180r/min搖床發(fā)酵10d，此條件下菌絲生物轉(zhuǎn)化量為51.004g/L，比之前得到大幅度提高。實測值與擬合值相比，相對誤差約為2.098%。說明該模型可靠性較高，能很好地預(yù)測試驗結(jié)果。相比現(xiàn)有報道，本研究所得香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量較高，菌絲球小、密度大且大小均勻，同時生產(chǎn)工藝簡單且成本低，可為香菇南山1號菌株的液體種生產(chǎn)和栽培提供理論參考。

作者：陳文強喬艷明單位：陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心