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第1篇

【摘要】 目的制備氫醌脂質體并測定含量及包封率。方法采用蒸發超聲法制備氫醌脂質體，高效液相色譜（HPLC）法檢測氫醌含量及包封率。結果色譜條件下氫醌與輔料、溶劑峰分離良好，氫醌在5.0～50.0 μg/ml范圍內線性關系良好。3組氫醌脂質體包封率分別為83.26%，89.13%，80.75%。結論氫醌脂質體制備工藝可行，質量控制方法簡單、準確。

【關鍵詞】 氫醌； 脂質體； 高效液相色譜法

Abstract：ObjectiveTo prepare and determine the content and entrapment efficiency of Hydroquinone liposome.MethodsHydroquinone liposome was prepared by evaporating and ultrasound method， determined the concentration and the entrapment efficiency of Hydroquinone liposome by HPLC. ResultsHydroquinone had a good linear relationship in a range of 5.0 ～50.0 μg/ml. The entrapment efficiency of Hydroquinone liposome in three groups reached 83.26%， 89.13%， 80.75% respectively.ConclusionThe technology of preparing Hydroquinone liposome was feasible and the method of quality control was simple and accurate.

Key words：Hydroquinone; Liposome; HPLC

氫醌制劑臨床上主要用于治療色素性皮膚病，如黃褐斑、雀斑、黑變病、炎癥后色素沉著等，是一種有效的臨床藥物［1，2］。國內制劑氫醌霜，化學性質不穩定，易氧化變色，限制了其應用［3］。筆者制備了氫醌脂質體制劑，以期達到促進皮膚滲透，防止氧化，減少不良反應等目的。

1 試劑與儀器

紫外可見分光光度計（美國Biogate公司）；高效液相色譜儀，色譜C18柱(4 μm， 150 mm ×3.9 mm) (日本島津公司)；超聲波分散儀(Meico Fisher Scientific公司)；冷凍真空干燥機(美國LABCONCO公司)；激光粒度分析儀(英國馬爾文公司)；恒溫磁力攪拌器(金壇市富華儀器有限公司)；電子天平(湖南湘儀醫療器械廠)；旋轉蒸發儀（上海青浦滬西儀器廠）；循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；高速攪拌機（IKA WERKE公司）。

大豆卵磷脂(純度>95% ，上海化學試劑公司) ，膽固醇(上海化學試劑公司) ， 氫醌對照品(甲醇精制，鈰量法測得含量達99.8%) ， 氫酯原料藥(沈陽市試劑五廠) ，葡聚糖凝膠G－50 (上海化學試劑公司，進口分裝) ，甲醇(江蘇漢邦有限責任公司，色譜純)，曲拉通X-100（上海化學試劑公司），乙醚（上海化學試劑公司，分析純），三蒸水（自制）。

2 方法與結果

2.1 配方設計與制備方法氫醌脂質體以磷脂和膽固醇為膜材，加入三蒸水終體積為10 ml。將氫醌原料藥、磷脂、膽固醇按比例混勻，再加入適量乙醚溶液充分溶解，真空減壓，去除有機溶劑，得均勻干膜。加入三蒸水，在25℃下高速攪拌，充分水化，獲得粗脂質體。然后將獲得的樣品，轉入超聲波乳化器，在一定超聲強度下持續超聲10 min，得到粒徑均勻的脂質體，充氮氣，分裝，真空冷凍干燥。

2.2 色譜條件與系統適應性色譜柱為C18柱，以甲醇：水( 1∶3) 為流動相，柱溫為室溫，檢測波長為280 nm ，流速為0.8 ml/min，進樣量為20 μl。采用外標法。在選定的色譜條件下，以氫醌計算理論塔板數為7 622，符合《中國藥典》高效液相色譜分析方法的要求。

2.3 色譜行為取氫醌對照品溶液、空白脂質體破乳溶液（破乳采用曲拉通X-100）和氫醌脂質體各20 μl進樣分析，得色譜圖1～3。由圖可見，氫醌的保留時間約為6.3 min，空白脂質體只在5 min以前有色譜峰，表明輔料對氫醌的測定無干擾。

圖1 空白脂質體色譜圖（略）

圖2 氫醌對照品色譜圖（略）

圖3 氫醌脂質體色譜圖（略）

2.4 標準曲線　取干燥至恒重的氫醌對照品50 mg ，精密稱定，置50 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密量取對照品溶液0.5 ，1.0 ，2.0 ，3.0 ，4.0 和5.0 ml，分別置100 ml量瓶中，各三蒸水稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件，進樣20 μl/次，實驗結果表明，當氫醌在5～50 μg/ml的濃度范圍內，以對照品峰面積 (Y) 為縱坐標，對照品濃度(X) 為橫坐標作圖， 得一直線。回歸方程為Y=2 920.6X+17.8072，r=0.992 7。

2.5 精密度測定取上述濃度為5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 μg/ml的氫醌對照品溶液， 于1d和1周內重復進樣5次，進樣量為20 μl，測定日內精密度和日間精密度。日內差異RSD為0.92% (n=5)， 日間差異RSD為1.01 %(n=5)。

2.6 回收率測定按處方比例加入0.5 ml空白脂質體混懸液至1～5號100 ml棕色容量瓶中，依次準確加入氫醌對照品貯備液0.5 ，1.0 ，2.0 ，3.0 ，4.0 和5.0 ml，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得濃度范圍為5～50 μg/ml的樣品溶液，分別進樣20 μl，測定峰面積，連續5次，計算回收率，結果平均回收率為97.58%(n =6) ，RSD為0.75 %。

2.7 脂質體中氫醌的含量測定精密吸取氫醌脂質體0.5 ml(相當于氫醌0.5 mg)，置于25 ml棕色容量瓶中，曲拉通X-100破乳，加入流動相稀釋對刻度，搖勻，作為供試液;準確配制濃度為20.0 μg/ml的氫醌對照品溶液。取上述溶液各20 μl進行分析，記錄色譜圖。按外標法計算出供試品中氫醌的含量。不同批號氫醌脂質體中藥物含量測定結果見表1。

表1 含量測定結果（略）

2.8 氫醌脂質體包封率的測定取氫醌脂質體100 μl于5 ml褐色容量瓶，補充甲醇至刻度，搖勻， HPLC測定藥物含量，乘以稀釋倍數即得全藥濃度。取相應氫醌脂質體1 ml，采用葡聚糖G-50凝膠柱，以蒸餾水為洗脫液，流速1 ml/min，過濾分離氫醌脂質體及游離氫醌，收集所有氫醌脂質體準確測量其體積， HPLC測定藥物含量。包封率（%）=（C脂/C總）×100%。測定3個批號脂質體的包封率分別為83.26%，89.13%，80.75%。

2.9 氫醌脂質體粒徑大小測定室溫下用激光粒度儀測定其平均粒徑，入射角度90°，設定樣品溫度為25℃時進行測量，每個樣品連續測量3次。測得氫醌脂質體粒徑均勻，粒徑為(220±35)nm。

3 討論

自20世紀60年代脂質體作為藥物載體應用以來，目前世界上已有多個脂質體制劑得到批準應用。本研究采用蒸發超聲法制備的脂質體粒徑均勻，分布范圍窄，藥物含量穩定，包封率達80%以上。由于氫醌極不穩定，所有操作最好在暗室中進行，實驗中使用棕色容器，且避免高溫。凍干時加用海藻糖作為保護劑。氫醌制劑含量測定采用鈰量法和紫外分光光度法，但操作繁瑣費時，本研究采用高效液相色譜測定法，通過提高流動相中水的比例，使保留時間延長，由于色譜柱的差異，可適當調整流動相的比例，以滿足含量測定的要求。此法可用來測定本品含量，結果準確可靠，重現性好。

參考文獻

［1］ 王建華，雷 帆，崔景榮. 20種中藥對酪氨酸酶抑制作用的研究［J］.中國藥學雜志，2000，35(4):232.

第2篇

【摘要】

目的建立高效液相色譜法測定杜仲愈傷組織和懸浮細胞中綠原酸含量。方法利用Hypersil C18-ODS柱(250 mm×4.6 mm， 5μm)色譜柱，乙腈-水-磷酸溶液(12∶87.9∶0.1)為流動相，檢測波長為327 nm，流速1.0 ml/min，柱溫為25℃。結果綠原酸在2.216～55.4 μg/ml范圍內線性關系良好，r=0.998 1，愈傷組織和懸浮細胞中綠原酸的平均加樣回收率分別為100.69%和97.62%，RSD分別為2.42%和2.71%。結論該方法快速簡便，準確可靠。杜仲愈傷組織和懸浮細胞中綠原酸含量分別為1.528 mg/g和3.949 mg/g。

【關鍵詞】 杜仲 愈傷組織 懸浮細胞 綠原酸 高效液相色譜法

Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of chlorogenic acid in callus and suspension cells of Eucommia ulmoides Oliv. MethodsThe separation was performed on Hypersil C18-ODS (250mm×4.6mm，5μm) column， using acetonitrile-water-H3PO4 (12∶87.9∶0.1)as mobile phase， detected at 327 nm. The flow rate was 1.0 ml/min， the column temperature was 25 ℃.ResultsThe linear range of chlorogenic acid was 2.216～55.4 mg/ml， r=0.998 4， the average recovery of chlorogenic acid in casllus and suspension cells were 100.69% and 97.62%， RSD were 2.42% and 2.72%， respectively. ConclusionThe method is rapid， simple， accurate and stable. Chlorogenic acid content in callus and suspension cells of Eucommia ulmoides Oliv are 1.528 mg/g and 3.949mg/g respectively.

Key words：Eucommia ulmoides Oliv; Callus; Suspension cell; Chlorogenic acid; HPLC

杜仲Eucommia ulmoides Oliv為杜仲科杜仲屬植物，為我國名貴中藥材，具有補肝腎、強筋骨、安胎、降血壓之功效［1］。近年來，我國的制藥工業、保健品生產以及工業材料等方面對杜仲的需求不斷增加［2］。人們為了追求短期經濟效益，無計劃人工砍伐開采杜仲資源，加之杜仲生長緩慢，自然環境的破壞等原因，杜仲野生資源日趨枯竭，已經不能滿足人們的需要。因此除充分利用現有野生杜仲資源外，利用杜仲愈傷組織和細胞的大規模培養來獲得高含量藥用成分的材料提供給杜仲工業市場已成為一種發展趨勢。綠原酸是杜仲中一種重要的活性成分， 具有抗菌、抗病毒、保肝、降壓等藥用功效，2005版《中國藥典》將其量的高低定為評價杜仲藥用價值的主要技術指標之一［3］。利用HPLC法測定杜仲綠原酸的研究已有大量報道［4，5］。為了配合杜仲愈傷組織和細胞培養的研究，本研究建立了測定杜仲愈傷組織和懸浮細胞中綠原酸的HPLC方法，并利用HPLC法對愈傷組織和由杜仲疏松愈傷組織建立的懸浮細胞系下培養所得的細胞中綠原酸進行了含量測定，從而為利用細胞工程方法生產綠原酸提供一定的實驗依據。

1 材料與儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(配備四元泵，VWD檢測器，真空脫氣機，柱溫箱)，Hpchem工作站，KQ-500DB數控超聲清洗器，Sartorius萬分之一電子天平，0.45μm過濾器，冷凍干燥系統。綠原酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供。杜仲愈傷組織按文獻［6］方法進行誘導和繼代培養，愈傷組織2周繼代1次，繼代3次后，將愈傷組織取出，真空冷凍干燥后供樣品制備用。懸浮細胞是按考獻［7］方法篩選所得疏松愈傷組織在本實驗室優化所得的液體培養基下，置于搖床中進行懸浮培養所得。培養1周后，將其取出真空冷凍干燥供樣品制備用。樣品提取所用甲醇為分析純，HPLC用乙腈、磷酸為色譜純，水為三蒸水。

2 方法

2.1 色譜條件色譜柱Hypersil C18-ODS柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為乙腈-水-磷酸溶液(12∶87.9∶0.1)；檢測波長為327 nm；流速1.0 ml/min；柱溫為25℃；進樣量為10μl，采用面積外標法。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品2.77 mg，置50 ml容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得含綠原酸0.0554 mg/ml的標準溶液。分別精密吸取標準溶液0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，置于5 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。

2.3 樣品溶液的制備精密稱取杜仲愈傷組織和懸浮細胞干粉各0.2 g于置10 ml容量瓶中，準確加入50%甲醇9 ml，置超聲清洗器中超聲提取60 min，取出放冷至室溫，搖勻，過濾，取續濾液定容到10 ml容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾即為樣品溶液。

3 結果

3.1 綠原酸的色譜分析在“2.1”項色譜條件下，綠原酸標準品、杜仲愈傷組織及懸浮細胞溶液的色譜分析見圖1~3。樣品中綠原酸峰與其他非被測成分峰能夠達到基線分離，可根據標準品洗脫峰所得保留時間確定樣品溶液中綠原酸的峰。

圖1 綠原酸標準品HPLC圖譜（略）

圖2 愈傷組織中綠原酸HPLC圖譜（略）

圖3 懸浮細胞中綠原酸HPLC圖譜（略）

3.2 標準曲線的制備取按“2.2”項方法制備的儲備液進行標準曲線的制備。每個對照品儲備液進樣10 μl，測定峰面積。以峰面積值（Y）為縱坐標，其對應進樣質量濃度(X， μg/ml)為橫坐標，進行回歸計算，得線性方程為：Y=71.904X-40.479，r=0.998 1。表明綠原酸濃度為2.216～55.4 μg/ml范圍內具有良好的線性關系。

3.3 精密度實驗 精密吸取對照品溶液重復進樣5次，每次10 μl ，分別測定峰面積，綠原酸峰面積的RSD(相對標準偏差)為0.8%。表明儀器精密度和進樣方法良好。

3.4 重復性實驗準確稱取杜仲愈傷組織和懸浮細胞樣品各5份，每份0.2 g，按“2.3”項下方法制備樣品溶液，進樣分析，測定綠原酸峰面積，外標法計算含量。杜仲愈傷組織和懸浮細胞樣品中綠原酸含量的RSD分別為1.8%和2.4%。表明樣品處理方法重復性好。

3.5 加樣回收率實驗準確稱取已知綠原酸含量的愈傷組織和懸浮細胞樣品各5份，每份0.2 g，分別加入適量綠原酸對照品，按“2.3項”下操作制備樣品溶液，進樣10 μl， 測定綠原酸含量，計算加樣回收率。結果見表1和表2。

表1 愈傷組織中綠原酸加樣回收實驗結果（略）

表2 懸浮細胞中綠原酸加樣回收實驗結果（略）

3.6 樣品測定結果根據上述條件對愈傷組織和綠原酸樣品進行含量測定，每樣品3份。結果見表3。綠原酸的含量在愈傷組織和懸浮細胞中有較大的差別。懸浮細胞中綠原酸的平均含量為愈傷組織中的2.6倍，說明在懸浮細胞中綠原酸的積累更有優勢。

表3 杜仲愈傷組織和懸浮細胞綠原酸含量（略）

4 討論

4.1 提取方法的選擇目前提取杜仲中活性成分（綠原酸）主要包括超聲、回流和冷浸等方法，提取相一般為水和有機溶劑［8］。本文以杜仲愈傷組織為材料對提取方法進行考察，比較了甲醇的含量及提取時間對提取效率的影響。以水、20%甲醇、50%甲醇、80%甲醇為溶劑，超聲提取60 min，結果以50%甲醇為溶劑時，色譜峰分離效果最佳，而且提取完全；比較l5，30，60，90 min的超聲提取效果，結果60 min時提取效率最高。

4.2 綠原酸測定方法的建立實驗采用HPLC測定杜仲愈傷組織和懸浮細胞中綠原酸的含量，結果準確，精密度高，重復性好，平均加樣回收率分別為100.69%和97.62%，RSD為2.42%和2.71%。說明該方法可用于杜仲愈傷組織和懸浮細胞規模生產中活性成分的定量分析。

4.3 杜仲的愈傷組織和細胞培養由于野生資源的匱乏，通過愈傷組織和細胞培養生產所需要的目標產物愈來愈引起人們的重視與關注。實驗表明來源于杜仲種子誘導產生的愈傷組織和懸浮細胞都能夠產生綠原酸，質量分數為1.528 mg/g和3.949 mg/g。同野生杜仲葉中報道的綠原酸相比，愈傷組織和懸浮細胞中含量還有待提高［9］。我們將進一步通過高產細胞株系的篩選和培養條件的探索與優化，使其達到或超出天然來源的含量［10，11］。利用杜仲細胞的大規模懸浮培養生產有關活性代謝產物將具有廣闊的前景。

參考文獻

［1］ 管淑玉， 蘇薇薇. 杜仲化學成分與藥理研究進展［J］. 中藥材， 2003， 26(2): 124.

［2］ 程光麗. 杜仲有效成分分析及藥理學研究進展［J］. 中成藥， 2006， 28(5): 723.

［3］ 國家藥典委員會. 中國藥典，Ⅰ部［S］. 北京: 化學工業出版社， 2005: 114.

［4］ 劉圣金， 狄留慶， 康， 等. 高效液相色譜法測定杜仲中綠原酸的含量［J］. 中國中醫藥信息雜志， 2006， 13(1): 44.

［5］ 石少瀾， 王祝舉， 邵愛娟， 等. 高效液相色譜法測定杜仲皮中綠原酸的含量［J］. 中國中藥雜志， 2005， 30(9): 715.

［6］ 邱曉芳， 朱 篤， 張志斌，等. 杜仲愈傷組織繼代培養基抑制褐化的研究［J］. 食品科學， 2007， 28(8): 307.

［7］ 邱曉芳， 朱 篤， 張志斌， 等. 杜仲疏松愈傷組織誘導條件的優化篩選［J］. 食品科學， 2006， 27(11): 375.

［8］ 劉輝琳， 唐明林， 安蓮英， 等. 杜仲藥用有效成分提取方法研究［J］. 天然產物研究與開發， 2002， 12(6): 47.

［9］ 尉 芹， 景謙平， 馬希漢. 杜仲葉中綠原酸的提取工藝條件研究［J］. 林產化學與工業， 2001， 21(4): 27.

第3篇

一、以法宣工作為中心，狠抓了普法依法治理工作

年初，我們針對普法依法治理工作實際，拿出了一些切實可行的辦法和措施。首先，我們制定了普法依法治理工作要點。明確了今年的工作目標和作務。我們今年把迎接全市全省“五五”普法驗收列為重中之重。我們為此專門制作了反映我區“五五”普法成果的專題片。我們還精心排練了一場大型的文藝演出。面對我區基層五五普法工作薄弱的實際情況，我們制定了區五五普法驗收考評標準。加強了對各單位的檢查考核。其次，我們建立的嚴密了法律宣傳組織體系。區級成了領導小組，各單位層層落實了組織機構和具體工作人員，使五五普法工作層層有人抓，處處有人管。一年來，我們共組織大型宣傳活動五次，開展培訓講座10多次。收到了好效果。

二、以民事調解工作為基礎，確保一方平安

今年的民事調解工作中，我們加強了對基層工作的指導。年初我們舉辦了基層民調工作人員培訓班，在培訓中我們針對工作實際，拿出了一些切實可行的辦法。使我區基層民調人員整體素質有了很大的提高。通過一年來的不懈努力，全年我們共調解案件264起，調解成功率在90%以上。無民轉刑案件的發生。

三、以安置幫教工作為載體，竭力幫助弱勢群體

我區目前共有兩放人員256名，其中今年放回58名。這些人員大多數沒有一技之長，流向社會，是社會的不穩定因素之一。我們針對此，聯系有關部門，加強對他們進行就業技能的培訓。為他們就業想盡一切辦法。目前，我區兩放人員安置率已達90%以上，今年兩放人員安置率達70%以上。

四、以法律援助方式，增強為民服務意識