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作者：吳曉果熊海濤杜華華單位：浙江大學飼料科學研究所

細胞免疫

對蝦血淋巴細胞分為透明細胞、半顆粒細胞和顆粒細胞，主要具有吞噬、包囊和胞吐功能，能夠合成和釋放多種免疫活性因子參與體液免疫［16］。研究發現，30℃高溫組的羅氏沼蝦（Macrobrachiumrosenbergii）血淋巴細胞的吞噬和清除能力顯著高于20℃常溫組，說明高溫具有促進對蝦血淋巴細胞免疫力的作用［17］。而且高溫感染組對蝦的血淋巴細胞總數顯著高于常溫感染組［10］，表明在高溫下感染對蝦白斑綜合征病毒能誘導宿主細胞非特異性免疫力升高。

體液免疫

對蝦等甲殼類動物體內沒有類似T淋巴細胞和免疫球蛋白等特異性抗體，酚氧化酶激活系統在對蝦非特異性免疫中起著關鍵作用。酚氧化酶是合成黑色素的關鍵酶，能誘導多種血淋巴細胞的體液防御反應［18］。在高溫下用美人魚發光桿菌（Photobacteriumdamsel）感染對蝦，其酚氧化酶、超氧化物歧化酶、呼吸爆發活性均顯著高于常溫感染組［19］。高溫下感染對蝦白斑綜合征病毒的日本囊對蝦（Marsupenaeusjaponicas）誘導出的酚氧化酶活性顯著高于常溫感染組［10］。表明高溫條件下感染對蝦白斑綜合征病毒，對蝦的非特異性免疫力高于常溫感染組，能夠在一定程度上抵御感染。

細胞凋亡

細胞凋亡是高度調控的細胞程序性死亡，在維持多細胞動物細胞穩態、細胞數量和組織大小等方面具有十分重要的作用。在細胞凋亡過程中，細胞內外凋亡信號依靠著一系列精確調控的半胱氨酸蛋白酶介導的酶促級聯反應和能量依賴性，最后由半胱氨酸蛋白酶－3執行關鍵的凋亡程序［20］。在病毒感染宿主細胞的過程中，病毒會激發宿主細胞內的相關感受器，隨即激發細胞內的凋亡反應。當病毒感染細胞誘發凋亡后，感染細胞會通過提前溶解，形成凋亡小體并被周圍的細胞吞噬，不引起炎癥反應，進而起到消滅病毒的作用，所以細胞凋亡在宿主細胞抵抗病毒感染的過程中起著重要作用［21－22］。另一方面，入侵的病毒為了復制更多的子代病毒，會分泌多種抗凋亡蛋白與凋亡通路中的關鍵蛋白作用，起到阻斷或者延遲細胞凋亡的作用［20］。整個病毒感染過程中，宿主細胞的凋亡和病毒蛋白的抗凋亡作用相互對抗，特別是在病毒感染的初期尤為關鍵。

高溫感染對蝦白斑綜合征病毒誘發的細胞凋亡

在常溫下感染對蝦白斑綜合征病毒后，隨著病毒感染程度的加重，斑節對蝦（Penaeusmonodon）細胞凋亡指數上升，直至死亡［23］。對人正常皮膚和尖銳濕疣的皮膚局部高溫處理后，均檢測到了凋亡信號［24］，表明病毒和高溫均能誘導宿主細胞凋亡。高溫感染組的凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）的平均凋亡指數顯著高于常溫攻毒組（P＜0．05），在觸角腺、甲殼下上皮組織、結締組織、心臟、肝胰腺、淋巴器官、心包膜、胃上皮中均檢測到了不同程度的細胞凋亡，而到感染后期凋亡指數下降［25］。這個趨勢與對蝦白斑綜合征病毒在高溫條件下的增殖趨勢一致（結果待發表①），表明細胞凋亡對于對蝦白斑綜合征病毒在宿主體內的增殖具有一定的抑制作用。在凋亡信號通路中，需要活化一系列的半胱氨酸蛋白酶，最后由半胱氨酸蛋白酶－3執行凋亡程序。目前，已在斑節對蝦、墨吉明對蝦（Fennero－penaeusmerguiensis）、凡納濱對蝦中成功克隆出了半胱氨酸蛋白酶－3，對蝦白斑綜合征病毒感染會誘導其表達量顯著增加（P＜0．05）［26－28］。在日本囊對蝦中，用RNAi干擾半胱氨酸蛋白酶后，宿主細胞的凋亡率下降，病毒增殖［29］。進一步表明細胞凋亡對于宿主細胞抵抗對蝦白斑綜合征病毒感染的重要性。

病毒的抗凋亡作用

研究發現，用非特異性凋亡誘導劑放線菌素D處理細胞后，會誘導細胞出現凋亡，但是用對蝦白斑綜合征病毒感染后，會抑制細胞凋亡［30］。在細胞凋亡抑制過程中，對蝦白斑綜合征病毒合成了多個抗凋亡蛋白作用于細胞凋亡途徑的不同蛋白。目前發現的對蝦白斑綜合征病毒抗凋亡基因有ORF390、WSSV222和VP38等，其產物分別通過切割半胱氨酸蛋白酶－3的DEVD272↓G和半胱氨酸蛋白酶－9的VETD233↓G、LEHD303↓G位點、利用泛素化作用介導腫瘤抑制樣蛋白降解、抑制半胱氨酸蛋白酶－3啟動子的活性來發揮抗凋亡作用［31－33］。但是關于高溫與對蝦白斑綜合征病毒抗凋亡基因作用之間的關系尚未見報道。

熱休克蛋白

熱休克蛋白具有高保守序列，在各物種中均有表達。熱休克蛋白具有折疊、組裝、細胞內定位、分泌、調控和降解其他蛋白的作用。根據熱休克蛋白的序列同源性和分子質量，將熱休克蛋白分為熱休克蛋白110、熱休克蛋白100、熱休克蛋白90、熱休克蛋白70、熱休克蛋白60、熱休克蛋白40、熱休克蛋白10和小熱休克蛋白家族［34］。生物體受到應激（如高溫、氧化應激、細菌、病毒感染等）都會誘導熱休克蛋白的表達，而熱休克蛋白70家族的基因序列最保守，研究得也最深入，細胞受到應激后變化最顯著［35］。熱休克蛋白70家族主要包含有組成型熱休克蛋白70和誘導型熱休克蛋白70［36－37］。在正常環境條件下，組成型熱休克蛋白70在各物種中均保持低水平表達，即使在應激條件下，其表達量變化也不顯著［38－39］。但在應激條件下，誘導型熱休克蛋白70表達量則會顯著升高［40－41］。雖然二者在表達模式上差異極大，但結構相似：在N－末端44ku的ATP結合結構域和C－末端30ku的底物結合結構域［42］。目前發現誘導型熱休克蛋白70基因缺失內含子，而組成型熱休克蛋白70含有內含子［43］，這種基因上的結構正好對應誘導型熱休克蛋白70，能夠在應激狀態下快速表達，有效保護細胞免受應激損害。高溫能夠誘導誘導型熱休克蛋白70的表達，提高宿主細胞的耐熱性，幫助細胞度過高溫應激狀態。

1組成型熱休克蛋白

70對高溫對蝦白斑綜合征病毒感染的作用目前，已在斑節對蝦、中國明對蝦（F．chinen－sis）、凡納濱對蝦、羅氏沼蝦等主要對蝦中克隆出組成型熱休克蛋白70，為研究其作用機制提供了豐富的理論基礎［44－47］。研究發現，在乳頭瘤病毒、腺病毒、輪狀病毒感染宿主細胞時，組成型熱休克蛋白70能夠協助病毒入侵細胞、病毒蛋白組裝、降解、細胞轉換、病毒DNA復制等［48－50］，表明組成型熱休克蛋白70能夠誘導一些病毒感染宿主細胞。在對蝦白斑綜合征病毒感染對蝦過程中，組成型熱休克蛋白70依靠其三磷酸腺苷結合結構域和多肽結合結構域，與對蝦白斑綜合征病毒系統性感染相關蛋白VP28作用，表現出特異性結合和三磷酸腺苷依耐性，協助其感染宿主細胞［51－52］。在常溫下，對蝦白斑綜合征病毒感染初期，組成型熱休克蛋白70的表達量升高，半胱氨酸蛋白酶－3活性很低；但在感染晚期，組成型熱休克蛋白70的表達量下降，半胱氨酸蛋白酶－3的活性顯著升高；用組成型熱休克蛋白70的dsRNA作用對蝦白斑綜合征病毒感染對蝦發現，其細胞內的半胱氨酸蛋白酶－3活性顯著升高［53］。這種組成型熱休克蛋白70的表達水平與宿主細胞凋亡之間的關系表明，對蝦白斑綜合征病毒的感染能夠誘導宿主組成型熱休克蛋白70的表達，進而抑制細胞凋亡，最后病毒順利增殖。而在高溫下，組成型熱休克蛋白70的mRNA表達量僅在高溫應激的1h內增加2～3倍，0．5h后即恢復至正常水平［44］。前期研究表明，組成型熱休克蛋白70受到高溫和病毒刺激后的短暫時間內表達量上升，隨即恢復到正常水平，但是組成型熱休克蛋白70正常表達量較少，所以在高溫抑制對蝦白斑綜合征病毒感染的過程中并不會起主導作用，不會影響整個感染過程。

2誘導型熱休克蛋白

70對高溫對蝦白斑綜合征病毒感染的作用誘導型熱休克蛋白70是熱應激反應的關鍵效應蛋白，具有高保守性和分子伴侶作用，在細胞內發揮蛋白折疊、細胞周期調控和抗凋亡作用［54］。在羅氏沼蝦（GenBankNo：AY466445）、斑節對蝦（GenBankNo：AF474375）、凡納濱對蝦（GenBankNo：AY645906）、克氏原螯蝦（Procambarusclar－kii）（GenBankNo：DQ301506）等主要養殖對蝦中成功地克隆出了誘導型熱休克蛋白70。基于這些基因信息，針對高溫抑制對蝦白斑綜合征病毒增殖的分子機制展開工作，能夠深入研究誘導型熱休克蛋白70的作用。在對流感病毒和仙臺病毒的高溫研究中發現，誘導型熱休克蛋白70能夠抑制細胞核釋放核糖核酸蛋白復合體來阻止流感病毒的增殖［55］；誘導型熱休克蛋白70能夠破壞HN蛋白的組裝來抑制仙臺病毒的復制［56］。伴隨高溫抑制對蝦白斑綜合征發病的過程，對蝦白斑綜合征病毒的增殖受到顯著的抑制，誘導型熱休克蛋白70的mRNA水平和蛋白水平均顯著升高；通過特異的RNA干擾作用，誘導型熱休克蛋白70的表達水平下降，對蝦白斑綜合征病毒增殖［57］。這表明誘導型熱休克蛋白70的表達升高能夠顯著抑制對蝦白斑綜合征病毒的增殖，但是關于二者相互作用的分子機制還有待進一步研究。誘導型熱休克蛋白70依賴其ATP結合結構域和多肽結合結構域，能夠與線粒體途徑的上游和下游關鍵凋亡蛋白相互作用，抑制細胞外和細胞內凋亡途徑［58］。雖然誘導型熱休克蛋白70具有一定的抗凋亡作用，但是在高溫抑制對蝦白斑綜合征發病的過程中，細胞凋亡率顯著高于常溫感染組，對蝦白斑綜合征病毒增殖數量顯著低于常溫感染組，表明誘導型熱休克蛋白70的抗凋亡作用在高溫抑制對蝦白斑綜合征中作用不顯著。誘導型熱休克蛋白70和組成型熱休克蛋白70同屬于熱休克蛋白70家族，具有相同的蛋白結構域，已發現組成型熱休克蛋白70與對蝦白斑綜合征病毒的VP28直接作用，那么誘導型熱休克蛋白70能否直接與對蝦白斑綜合征病毒相關蛋白作用，從而抑制其增殖，有待試驗進一步證實。

結語

高溫條件下病毒感染引起宿主細胞的應激，具有細胞毒性作用，激發了宿主細胞一系列防御機制。非特異性免疫系統是對蝦最基本的防御機制，但是其作用有限，還需要其他機制來輔助抵抗應激：一是細胞凋亡的抗病毒作用。當病毒感染宿主細胞后，宿主細胞的凋亡機制和病毒的抗凋亡機制同時存在，兩者處于一個相互作用的過程，特別是在病毒感染的初期。二是誘導型熱休克蛋白70作用，高溫和病毒都能夠誘導誘導型熱休克蛋白70表達來對抗應激，保護細胞。雖然誘導型熱休克蛋白70具有抗凋亡作用，但是在高溫感染對蝦白斑綜合征病毒過程中，以抑制對蝦白斑綜合征病毒增殖為主，其抑制機制還尚無定論，需要深入研究誘導型熱休克蛋白70與對蝦白斑綜合征病毒何種蛋白相互作用關系，或者還有其他的機制存在。