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《實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志》2015年第二十期

痤瘡是皮膚科常見炎癥性疾病。痤瘡丙酸桿菌是痤瘡發(fā)病的重要因素，其過量繁殖可導(dǎo)致毛囊壁炎癥，伴隨大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)；痤瘡丙酸桿菌可刺激單核細(xì)胞分泌多種炎癥因子，從而加重皮膚炎癥。以上研究提示調(diào)控痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是治療痤瘡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前臨床常采用激素或抗生素治療痤瘡，但副作用較多且易產(chǎn)生耐藥性。因此，采用天然藥物來(lái)治療痤瘡具有重大臨床治療意義。姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)功能，但其對(duì)痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討姜黃素對(duì)痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及作用機(jī)制，以期為姜黃素臨床干預(yù)治療痤瘡提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1．1材料痤瘡丙酸桿菌由中科院上海健康科學(xué)研究所張雁云教授惠贈(zèng)；姜黃素購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；THP-1細(xì)胞株由本室保存；TNF-α和IL-8ELISA試劑盒購(gòu)自R＆D公司；CCK8試劑盒購(gòu)于Dojindo；TLR2抗體購(gòu)自Abcam公司；NF-κBp65抗體購(gòu)自SantaCruz公司；P-NF-κBp65抗體購(gòu)自CellSignal公司；β-actin抗體購(gòu)自碧云天公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購(gòu)自Bio-Rad公司。

1．2方法

1．2．1實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)空白對(duì)照組、痤瘡丙酸桿菌組及痤瘡丙酸桿菌＋姜黃素組（5、10、15μmol／L），共5組。THP-1細(xì)胞接種于6孔板，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／mL，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．2．2CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力將THP-1細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為10000細(xì)胞／孔，加入不同濃度的姜黃素培養(yǎng)4h，進(jìn)而加入痤瘡丙酸桿菌（15μg／mL）培養(yǎng)8h后，采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力，于450nm處測(cè)定光吸收值。設(shè)空白對(duì)照組細(xì)胞活力為100％。

1．2．3ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)THP-1細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／mL，加入不同濃度姜黃素培養(yǎng)4h，進(jìn)而加入痤瘡丙酸桿菌培養(yǎng)8h，采用ELISA試劑盒，按說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-8含量。

1．2．4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TRIzol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列如下：TLR2正向引物：5-ATCCTCCAATCAGGCTTCTCT-3，反向引物：5-GGACAGGTCAAGGCTTTTTACA-3；NF-κBp65正向引物：5-ATGTGGAGATCATTGAGCAGC-3，反向引物：5-CCTGGTCCTGTGTAGCCATT-3；GAPDH正向引物：5-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3，反向引物：5-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3。GAPDH為內(nèi)參，比較循環(huán)閾值法（2-△△Ct）分析基因相對(duì)含量。

1．2．5Westernblot檢測(cè)裂解細(xì)胞提取蛋白，蛋白電泳后按常規(guī)方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別加入抗TLR2、NF-κBp65、P-NF-κBp65及β-actin抗體。4℃孵育過夜后，經(jīng)HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，按ECL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行曝光、顯色。

1．2．6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用單因素方差分析，P＜0．05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2．1姜黃素對(duì)細(xì)胞活力的影響姜黃素在5~15μmol／L的濃度范圍內(nèi)，與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)12h后，對(duì)細(xì)胞的活力無(wú)明顯影響（圖1A）；當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至24h后，姜黃素明顯抑制了THP-1細(xì)胞活力，提示姜黃素的給藥時(shí)間在12h內(nèi)為宜（圖1B）。進(jìn)一步分析姜黃素對(duì)痤瘡丙酸桿菌處理后細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)與未處理組相比，痤瘡丙酸桿菌能明顯抑制THP-1細(xì)胞活力（P＜0．05）；然而與單純痤瘡丙酸桿菌處理組相比，姜黃素對(duì)THP-1細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。

2．2姜黃素對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清發(fā)現(xiàn)，痤瘡丙酸桿菌能促進(jìn)THP-1細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α和IL-8，姜黃素在10μmol／L與15μmol／L濃度時(shí)能明顯抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的TNF-α和IL-8分泌（P＜0．05），尤其在15μmol／L濃度時(shí)抑制效果尤為明顯。

2．3姜黃素對(duì)TLR2表達(dá)的影響?zhàn)畀彵釛U菌刺激后，THP-1細(xì)胞TLR2基因表達(dá)升高。與單純痤瘡丙酸桿菌刺激組相比，姜黃素給藥明顯抑制了TLR2基因的表達(dá)（P＜0．05，圖3A）。Westernblot進(jìn)一步證明姜黃素能有效降低痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的TLR2表達(dá)（圖3B）。

2．4姜黃素對(duì)NF-κBp65表達(dá)的影響實(shí)時(shí)定量PCR與Westernblot分析顯示，痤瘡丙酸桿菌刺激后，THP-1細(xì)胞NF-κBp65表達(dá)明顯升高；與單純痤瘡丙酸桿菌刺激組相比，姜黃素給藥明顯抑制了THP-1細(xì)胞NF-κBp65和P-NF-κBp65的表達(dá)（圖4）。

3討論

痤瘡常采用抗生素治療，但長(zhǎng)期使用能產(chǎn)生抗生素耐藥性。為避免抗生素耐藥性的產(chǎn)生，采用天然物質(zhì)來(lái)治療痤瘡受到廣泛關(guān)注。姜黃素是從植物姜黃中提取的天然物質(zhì)，具有強(qiáng)大的抗炎作用，然而其治療痤瘡的效果尚不清楚。姜黃素能通過抑制單核細(xì)胞活化來(lái)緩解多種炎癥性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的TNF-α和IL-8分泌。TNF-α和IL-8是痤瘡炎癥反應(yīng)中的重要炎癥因子，這些結(jié)果提示姜黃素可能通過抑制痤瘡丙酸桿菌引起的炎癥反應(yīng)來(lái)緩解痤瘡的發(fā)病。

痤瘡丙酸桿菌主要通過模式識(shí)別受體TLR來(lái)活化單核巨噬細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)TLR2在痤瘡的發(fā)病過程中有重要作用，痤瘡患者TLR2的表達(dá)明顯增高。敲除TLR2基因的小鼠接受痤瘡丙酸桿菌刺激后不能產(chǎn)生IL-6，而敲除其他TLR基因的小鼠接受痤瘡丙酸桿菌刺激后仍能產(chǎn)生大量IL-6。本研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡丙酸桿菌能明顯上調(diào)THP-1細(xì)胞TLR2的表達(dá)，姜黃素則抑制了痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的TLR2表達(dá)。提示姜黃素可能是通過降低TLR2表達(dá)來(lái)抑制單核細(xì)胞活化，導(dǎo)致單核細(xì)胞炎癥因子分泌減少而緩解痤瘡的炎癥反應(yīng)。TLR識(shí)別相應(yīng)配體后，主要通過MyD88途徑活化下游核因子NF-κB。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)，提示姜黃素可能是通過TLR2相關(guān)信號(hào)通路來(lái)調(diào)控痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

本研究在體外發(fā)現(xiàn)姜黃素能明顯抑制痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其治療作用尚需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下游信號(hào)通路也有待進(jìn)一步的研究。本研究結(jié)果將為姜黃素臨床治療痤瘡提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

作者：顧巧麗 蔡燕 楊惠林 施勤 單位：蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院